低剂量环磷酰胺联合树突状细胞瘤苗对荷舌鳞癌裸鼠的治疗观察

低剂量环磷酰胺联合树突状细胞瘤苗对荷舌鳞癌裸鼠的治疗观察作者：韩伟 胡勤刚　王志勇  　［摘要］  目的：观察低剂量环磷酰胺与树突状细胞瘤苗联合应用对裸鼠体内人舌癌细胞的抑瘤作用。方法：培养人外周血单核细胞来源的树突状细胞（DC），冻融法制备Tca8113舌癌细胞可溶性抗原并体外致敏DC，将同源人T淋巴细胞与之共同培养诱导出抗原特异性的CTL，联合低剂量环磷酰胺（Cy）共同接种至荷人舌癌的裸鼠。结果：抗原致敏的DC瘤苗与小剂量环磷酰胺联合后能比单用DC瘤苗更有效的治疗荷舌癌的裸鼠，与对照组相比，肿瘤生长明显抑制，生存率有显著提高（P<0.05）。结论：以冻融抗原致敏的DC激活产生肿瘤特异性的CTL联合小剂量Cy能更有效的促进荷瘤宿主的免疫反应，具有显著的体内抑制舌癌的效果。　　［关键词］  舌鳞癌  树突状细胞  环磷酰胺  免疫治疗　　Treatment of Established Tongue Squamous Cell Carcinoma-bearing Nude Mice By Dendrtic Cells Vaccine Combined With Low-dose Cyclophosphamide. HAN Wei, HU Qin-gang, WANG Zhi-yong. The Stomatological Hospital Affiliated to Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008　　［Abstract］Objective: To investigate the antitumor effects of dendritic cells (DC) pulsed with lysates of Tca8113 cells combined with low-dose cyclophosphamide(Cy). Methods: DC was cultured from peripheral blood monocytes(PBMC). After pulsed in vitro with Tca8113 cells lysates, DC was incubated with T lymphocytes to generate antigen-specific CTL, the tumor-bearing nude mice were treated with CTL and low-dose Cy. Results: The combination treatment could inhibit the growth of tumor, and the survival time of tumor-bearing mice was markedly prolonged. Conclusion: Tumor antigen pulsed DC combined with low-dose Cy could induce effectively in vivo antitumor immune response.　　［Key words］  Tongue squamous cell carcinoma  Dendritic cell  Cyclophosphamide(Cy)  Immunotherapy    舌鳞状细胞癌是口腔癌中较为常见的恶性肿瘤，尽管综合治疗已使其5年生存率达到60%左右，但仍不满意，为此生物疗法一直是目前研究的重点。树突状细胞（dendritic cell，DC）是体内最强的专职抗原提呈细胞（antigen－presenting cell，APC），应用肿瘤抗原致敏DC治疗肿瘤是DC研究领域的热点［1］。环磷酰胺（cyclophosphamide，Cy）是目前临床应用最广的化疗药物，能直接杀伤肿瘤细胞，并可选择性的去除体内的抑制性T细胞，因此我们设想联合应用二者，是否能有效的诱导并增强荷瘤宿主的免疫反应，从而取得更佳的治疗效果。1  材料与方法　　1.1  实验对象与材料  重组人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF），重组人白细胞介素-4（rhIL-4），重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）均购自Promega 公司， RPMI 1640培养基（GIBCO 公司），胎牛血清（Hyclone 公司），MTT试剂，二甲基亚砜（上海实生细胞生物技术有限公司），淋巴细胞分离液Ficoll（上海华精生物高技术公司），免疫磁珠Dynabeads M-450 CD19（Dynal Biotech），环磷酰胺购自Sigma公司。Tca8113 人舌黏膜鳞状细胞癌细胞株（上海第九人民医院肿瘤研究所惠赠）。4~6周龄雌性BALB/c裸鼠，购于中国科学院上海实验动物研究所，动物饲养及实验在南京中医药大学实验动物研究中心（SPF级动物实验室）完成。　　1.2  方法　　1.2.1  Tca8113舌癌细胞冻融抗原的制备  常规培养Tca8113 舌癌细胞，收集细胞，PBS洗涤2次，用RPMI 1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×106/mL，分别置于液氮和37 ℃水浴中反复冻融4次，5 000 r/min离心20 min，取上清液，经微孔滤膜过滤除菌，4 ℃备用。　　1.2.2  DC的体外培养及致敏  取健康志愿者抗凝外周血白细胞1 μ（30 mL），常规分离外周血单个核细胞（PBMC），用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640重悬细胞，并调整细胞浓度为2.5×106/mL加入24孔培养板中，每孔1 mL，培养2 h（37 ℃，5%CO2孵箱）。吸取悬浮的淋巴细胞，置于50ml培养瓶中继续培养。贴壁的单核细胞分别每孔加入rhGM-CSF 100 ng/ml，rhIL-4 40 ng/mL，培养第5天每孔加入rhTNF-α20 ng/mL，培养过程中每3 d半量换液一次。于培养第7天获得DC。收集培养第8天的DC，调整至1×106/mL，加入冻融抗原（按抗原与DC之比为10∶1，抗原量以冻融前肿瘤细胞的数量计），共孵育12 h。　　1.2.3  舌癌移植瘤模型的建立  收集对数生长期的Tca8113细胞，接种于裸鼠背部皮下1×106/只，14 d后所有荷瘤裸鼠被分为3组，每组10只，按表1行瘤周注射。每3 d测量一次肿瘤大小，并以公式V＝1/6×π×a×b×c计算肿瘤体积（a、b、c为肿瘤互相垂直的直径）。各时间点的肿瘤体积行单因素方差分析。观察荷瘤裸鼠的生存期和存活率，以肿瘤体积大于800 mm3，或肿瘤表面出现溃疡为小鼠死亡［2］，数据行Log-rank检验。　　1.2.4  实验动物分组情况  A组：DC (1.5×105/只)+致敏的T淋巴细胞（3×106/只）+Cy 25 mg/kg共1.0 mL；B组：DC (1.5×105/只)+致敏的T淋巴细胞（3×106/只）共1.0 mL；C组：注射PBS1.0 mL。2  结果　　2.1  DC的形态  倒置显微镜及.扫描电镜下分别见细胞表面伸出毛刺样突起，见图1。及褶皱样不规则突起，见图2。　　图1 － 图2  略　　2.2  冻融抗原致敏的DC联合低剂量Cy对荷瘤裸鼠的治疗效果  裸小鼠皮下接种Tca8113后，第14天所有裸鼠均可在皮下扪及肿瘤硬结，各组行不同方案治疗后，种植瘤初期生长缓慢，后期呈进行性快速生长。实验第47天测量的裸鼠肿瘤体积经方差分析,DC＋CTL+Cy组与其余2组相比有显著性差异（P<0.05），DC+CTL组与单纯PBS组之间也有显著性差异，见图3。在整个治疗观察期（47 d）中　　图3  各组裸鼠肿瘤生长曲线图　略　　A、B组裸鼠肿瘤表面均未出现溃疡，而PBS治疗组有5只裸鼠所荷肿瘤出现溃疡，至观察结束时所有裸鼠均为带瘤生存。按步骤1.2.4的限定，求出A组裸鼠平均生存期为47.000 d，B组为46.375 d， PBS治疗组为25.580 d，见图4。我们通过Kaplan-Meier方法计算出各组小鼠的生存率，结果行Log rank检验，发现A、B治疗组生存率与PBS组相比有显著差异（P<0.005），而A、B组之间无明显差异（P>0.05）。 　　图4  各组裸鼠的生存曲线图　略3  讨论    T细胞介导的免疫应答在机体抗肿瘤过程中发挥了重要作用。荷瘤宿主免疫应答缺失的主要原因之一是肿瘤细胞的弱免疫原性和宿主APC功能低下，使肿瘤抗原不能被充分提呈，以致T细胞介导的免疫应答不能被有效激活［3］。DC作为专职APC，能够摄取处理各种抗原，表达丰富的MHC分子、黏附分子和共刺激分子，具有强大的抗原提呈功能及免疫佐剂作用，诱导高效而特异性的抗肿瘤免疫［4］。    研究发现，在体外模拟DC成熟的过程中，运用各种形式的肿瘤抗原修饰DC，并将致敏DC回输体内，可有效诱发机体的特异性抗肿瘤免疫反应，但目前绝大多数口腔颌面部的肿瘤抗原未得到明确的鉴定。故在本实验中我们应用肿瘤细胞冻融抗原修饰DC，这相对于寻找特异性抗原、细胞因子等不失为一种简单、有效的方法。冻融抗原可呈递已知的和未知的肿瘤相关抗原，增加了触发特异性T细胞克隆的靶点，避免呈递单个或几个抗原而可能导致的免疫逃避。不利的方面是因为冻融抗原可能含有机体的正常抗原，其可能诱发自体免疫性疾病，但在目前的临床实践中并未发现与之相应的自体免疫反应［5,6］。    舌癌是最常见的口腔癌，在临床治疗上化疗一般作为晚期病例手术前后的辅助治疗手段，虽然大多数化疗药物可抑制免疫功能，但某些药物如环磷酰胺在一定剂量范围内对免疫功能损害不大，甚至可以增强免疫功能，其机制推测是低剂量环磷酰胺可选择性的去除抑制性T细胞［7］。在本实验中我们是应用低剂量环磷酰胺和DC对荷瘤裸鼠进行联合治疗，一方面化疗药物可诱导肿瘤细胞凋亡，另一方面凋亡细胞又可被DC摄取，递呈至淋巴细胞表面，诱导抗原特异性的免疫反应。国外Tong等［8］报道分别用Cy和阿霉素对鼠结肠腺癌及黑色素瘤进行全身化疗，并联合瘤内注射DC，可使肿瘤完全消退，这种小鼠对再次接种的肿瘤也能产生免疫。Yu等［9］也报道采用小剂量Paclitaxel与DC瘤苗联合治疗荷乳腺癌的小鼠，可观察到肿瘤的完全消退和持续的抗肿瘤再生的能力。    与国外报道相似，我们的实验结果证实采用Cy＋DC＋CTL联合治疗的小鼠与其余两组相比肿瘤体积大小有明显差异；DC＋CTL＋Cy组、DC＋CTL组与单纯PBS治疗组之间生存期有明显差异。由于裸鼠存在先天性免疫缺陷，缺乏自身抗肿瘤的能力，因此必须不断的借助于外源免疫活性细胞来维持这种免疫能力，而本实验仅对荷瘤裸鼠进行过一次低剂量环磷酰胺化疗和DC免疫治疗，至观察结束时没有一例裸鼠出现肿瘤完全消退现象。参考文献　　［1］  Auffermann-Gretzinger S, Keeffe EB, Levy S. Impaired dendritic cell maturation in patients with chronic, but not resolved,hepatitis C virus infection ［J］. Blood,2001,97(10)∶3 171-3 176　　［2］  唐华，曹雪涛，等.冻融抗原冲击致敏的树突状细胞对结肠癌小鼠的治疗作用［J］.中国肿瘤生物治疗杂志，2000,7(3)　　［3］  Celluzzi CM, Mayordomo JI, Storkus WJ, et al. Peptide-pulsed dendritic cells induce antigen specific CTL-mediated protective tumor immunity ［J］. J Exp Med, 1996, 183(1)∶283-287　　［4］  Worgall S, Busch A, et al. Modification to the capsid of the adenovirus vector that enhances dendritic cell infection and transgene-specific cellular immune responses ［J］.  J Virol, 2004, 78(5)∶2 572-2 580　　［5］  Sogn JA.Tumor immunology: The glass is half full ［J］. Immunity,1998,9(6)∶757-763　　［6］  Caux C, Massacrier C, Dubois B ,et al. Respective involvement of TGF-beta and IL-4 in the development of Langerhans cells and non-Langerhans dendritic cells from CD34+ progenitors ［J］. J Leukoc Biol, 1999, 66(5)∶781-791　　［7］  Awwad M, North RJ，et al. Cyclophosphamide-induced immunologically mediated regression of a cyclophosphamide-resistant murine tumor: a consequence of eliminating precursor L3T4+ suppressor T-cells ［J］.Cancer Res,1989,49(7)∶1 649-1 654　　［8］  Youzhi Tong, Wenru Song, et al. Combined intratumoral injection of bone marrow-derived dendritic cells and systemic chemotherapy to treat pre-existing murine tumors ［J］. Cancer Res, 2001, 61(20)∶7 530-7 535　　［9］  Bin Yu,Sergei Kusmartsev,et al.Effective combination of chemotherapy and dendritic cell administration for the treatment of advanced-stage experimental breast cancer ［J］. Clin Cancer Res, 2003, 9(1)∶285-294