茶多酚对复发性阿弗它溃疡大鼠模型外周血T淋巴细胞亚群的影响

茶多酚对复发性阿弗它溃疡大鼠模型外周血T淋巴细胞亚群的影响作者：梁文红 刘建国　郭玉苏 程茜 吴家媛 何奎芳 　　［摘要］  目的：探讨细胞免疫与复发性阿弗它溃疡（recurrent aphthous ulcer,RAU）发病机制的关系及茶多酚（tea polyphenols ,TP）对RAU的免疫调节作用。方法：用免疫方法建立SD大鼠RAU动物模型，将RAU大鼠随机分成阴性对照组、溃疡糊剂组和3个TP治疗组。用流式细胞仪检测成模前后及用药前后各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+细胞数量及比值。结果：实验大鼠溃疡模型成模后外周血CD4+及CD4+/ CD8+较成模前显著降低（P＜0.01），CD8+改变无统计学意义（P＞0.05）。茶多酚各治疗组外周血CD4+、CD4+/CD8+回升，与阴性对照组有显著性差异（P＜0.05），茶多酚各治疗组间比较没有显著性差异（P＞0.05）。结论：RAU的发生与细胞免疫功能抑制有关，TP对大鼠RAU具有免疫调节作用, 其免疫调节作用与给药方式无关。　　［关键词］  复发性阿弗它溃疡  T淋巴细胞  茶多酚  大鼠　　Experimental Study of Tea Polyphenols on T-Lymphocytes of Recurrent Aphthous Ulcer in Rats. 　　LIANG  Wen-hong, LIU Jian-guo, GUO Yu-su,et al. Department of Oral Medicine, Affiliated Stomatological Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi 563003　　［Abstract］Objective: To observe the relationship between cellular immune and the pathogenesis of recurrent aphthous ulcer (RAU) and to evaluate the immune regulation of tea polyphenols(TP)on RAU. Methods: RAU models were established by injecting antigens into SD rats. Five groups, including control group, ulcer cataplasm group and three TP therapeutic groups, were divided randomly. The changes of CD4+  and CD8+ values in blood were measured by flow cytometry (FCM). Results: Compared with normal group, the values of CD4+ and CD4+/CD8+ showed significantly lower level in RAU rats (P<0.01), while CD8+ not(P>0.05). After TP treatment, the values of CD4+ and CD4+/CD8+ increased significantly (P<0.05). It did not show any significant difference among three TP therapeutic groups(P>0.05). Conclusion: The inhibition of cellular immune function may contribute to RAU incidence; TP had the immune regulation on experimental RAU rats, which wasn’t related to the way of administration in this experiment. 　［Key words］  Recurrent aphthous ulcer  Tea Polyphenols  T-lymphocytes  Rat    复发性阿弗它溃疡(recurrent aphthous ulcer, RAU)，又称复发性口疮，复发性口腔溃疡，是最常见的口腔黏膜病，其发病率高达20%左右。国内外许多学者对RAU患者进行血液免疫学测定，认为它是与免疫状态有关的疾病［1，2］。RAU病因复杂，目前临床尚无有效的治疗方法。茶多酚（tea polyphenols,TP）又名茶单宁、茶鞣质，是茶叶中所含有的一类多羟基酚类化合物的总称。近年来的研究提示茶多酚具有抗氧化、抗衰老、抗癌变、调节免疫等多种生物学功能。本实验以免疫方法建立大鼠RAU动物模型，观察TP对大鼠RAU的免疫调节作用。1  材料与方法　　1.1  材料与主要设备　　1.1.1  实验动物  SD大鼠75只：雌性50只，雄性25只，体重180~200 g ，由第三军医大学野战外科研究所提供。等级：清洁级。　　1.1.2  实验试剂  卡介苗（冻干）由上海生物制品科研所出品（批号：200306001）；anti-CD4+-FITC、 anti-CD8+-FITC，由杭州科岛生物科技有限公司提供（批号：MR 5101 01020905）；溃疡糊剂由四川大学华西口腔医院药剂科提供（批号：20030910）；茶多酚（98%）由安徽省歙县茶叶生物碱厂提供；2%茶多酚糊剂由20mg茶多酚与980mg糊剂基质无菌研钵内研磨均匀制成，糊剂基质由天津市天骄制药有限公司提供（批号：20021108）。　　1.1.3  主要设备  Soniprep150超声粉碎机，Facscalibur(BD)流式细胞仪。　　1.2  方法　　1.2.1  建立RAU动物模型  将15只SD大鼠（雌）急性拉颈处死后剥取口腔黏膜组织，加生理盐水制成匀浆，超声波震荡。将上述口腔黏膜悬液逐滴加入弗氏佐剂内，顺同一方向研磨制成白色乳剂，放置后不分层，即为抗原乳化剂。在50只SD大鼠（雌雄比为1∶1）脊柱两侧剪去鼠毛，消毒后每侧皮内注射抗原乳化剂0.1 mL，每间隔两周注射1次，共注射5次，观察大鼠口腔黏膜出现典型RAU病变,即为RAU大鼠模型。其中，随机选取10只SD大鼠作为RAU模型组；另外，未注射该抗原乳化剂的剩余10只SD大鼠，即为正常对照组。从这两组实验大鼠眼眶取血，流式细胞仪检测正常组、模型组大鼠外周血CD4+、CD8+细胞数量。切取实验大鼠的口腔正常及溃疡组织切片，HE染色后进行组织学检查。　　1.2.2  不同剂型茶多酚对RAU动物模型的治疗  将40只RAU模型大鼠随机分为5组，每组8只。阴性对照组正常饮食，自由饮水。溃疡糊剂组溃疡糊剂涂抹口腔黏膜。茶多酚灌胃组，每只RAU大鼠以每日100 mg/kg剂量灌胃。茶多酚糊剂组，2%茶多酚糊剂涂抹口腔黏膜。茶多酚灌胃+糊剂组，每只RAU大鼠以每日100 mg/kg剂量灌胃及2%茶多酚糊剂涂抹口腔黏膜。以上均为每日1次，连续用药20 d。治疗完成后分别从实验大鼠眼眶取血，流式细胞仪检测各组大鼠外周血CD4+、CD8+细胞数量。　　1.3  统计学分析  所有实验数据用均数±标准差表示，制模前后用t检验，用药前后用F检验，检验水准为P＜0.05。2  结果　　2.1  RAU模型建立  SD大鼠于第3次免疫注射后第2天口腔黏膜开始出现溃疡，第4次免疫注射后所有大鼠均出现溃疡。溃疡多发生于颊、唇、牙龈及舌黏膜，溃疡呈圆形或椭圆形，边缘较整齐，表面有一层黄色假膜覆盖，直径约0.8~1.5 mm，一般3~5 d自行愈合，后又复发。取口腔黏膜溃疡标本镜检，镜下见黏膜上皮层坏死、脱落，表面覆盖大量中性粒细胞和纤维性渗出物，溃疡底部及上皮下小血管扩张充血，伴有中性粒细胞、淋巴细胞及单核细胞浸润。用流式细胞仪检测正常组及模型组大鼠外周血CD4+、CD8+细胞数量，结果见表1。　　表1  RAU大鼠成模前后血液各项免疫学指标　略　　2.2  TP治疗结果 应用溃疡糊剂及茶多酚对RAU大鼠治疗后，大鼠的进食、毛色、扎堆等一般情况明显改善。TP治疗20 d各组大鼠血液各项免疫学指标见表2。　　表2  茶多酚治疗20 d各组RAU大鼠血液各项免疫学指标　略3  讨论　　3.1  RAU与细胞免疫  RAU的发病机理一直是口腔黏膜病研究的热点。国内外许多学者对RAU患者进行血液免疫学测定，认为它是与免疫状态有关的疾病。早在1969年，Lehner就提出了细胞免疫在RAU发病机理中起着重要的作用。众所周知，CD4+促进免疫应答，CD8+抑制其反应，细胞免疫的稳定有赖于两亚群间的平衡，这种平衡失调，造成CD4+/CD8+比值的相应改变。CD4+/CD8+比值的下降增强了细胞内对各种非特异性和特异性致病因子的易感性，导致了口腔黏膜的局部破坏、坏死和溃疡的形成。但RAU与CD4+、CD8+细胞数量之间的确切关系目前尚无定论。有学者发现RAU患者CD4+细胞数量和CD4+/CD8+下降，CD8+细胞数量正常。Savage等［3，4］的研究却发现RAU患者CD4+细胞数量、CD4+/CD8+下降，CD8+细胞数量上升。结果的不一致可能与病例的选择、样本量及检测方法不同有关。本实验应用免疫方法建立大鼠口腔黏膜复发性溃疡模型，其病损特征及发作特点与人类RAU的临床特点极其相似，组织学检查也表明二者均为非特异性炎症。检测大鼠外周血CD4+细胞数量与CD4+/CD8+较正常对照组显著性降低，CD8+与正常对照组相比有升高趋势，但没有统计学意义，实验结果进一步证实了RAU的免疫学发病机理。　　3.2  茶多酚对RAU的治疗效果  有学者采用TP对动物体内外抑瘤作用和对细胞免疫功能影响进行测定，结果认为TP不仅具有明显抑制肿瘤的生长，而且还能增强和调节机体的非特异性免疫功能［5］。另有研究表明TP在体内外有促进胸腺或淋巴细胞增殖或致敏作用，并使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的百分率和吞噬指数明显提高，表明TP中可能存在非特异性因子激活巨噬细胞，增强机体非特异性免疫功能［6］。朱茂祥等［7］研究结果显示绿茶、复合茶和茶多酚3种茶制剂对致癌剂NNK（4-甲基亚硝胺-1-（3-吡啶）-1-丁酮）所致小鼠免疫功能异常的调节作用因免疫指标而异，具有双向调节作用。而且TP的主要成分儿茶素都可通过口腔黏膜吸收，茶多酚的这种代谢特性对于通过局部外用药物来治疗RAU是切实可行的［8］。本次实验中用茶多酚分别给予灌胃、局部涂药和灌胃加涂药治疗。当溃疡模型形成后，分别给予各组大鼠连续治疗20 d后，各治疗组外周血CD4+细胞数量、CD4+/CD8+均有回升，并与阴性对照组存在显著性差异，表明TP能增强细胞免疫。而且随着治疗的进行，各治疗组大鼠一般情况均表现出不同程度的改善。另外，TP糊剂组、灌胃组、TP灌胃+糊剂组3种不同剂型之间没有统计学差异，表明茶多酚的免疫调节作用与其给药方式无关，通过局部或全身吸收的TP均有提高RAU大鼠细胞免疫、调节T-淋巴细胞亚群之间的平衡的作用。中国是世界上最大的茶叶产地之一，茶叶资源十分丰富，在茶叶生产过程中产生的大量灰末、修剪叶、甚至滞销的粗老茶中TP含量很高，目前几乎全部作废料丢弃，如果利用起来，TP将有充足的资源保证。茶多酚具有调节免疫等生物学功能，必将在RAU治疗方面有着广阔的应用前景。参考文献　　［1］  向晓明，李成章，汪军，等.转移因子治疗复发性阿弗他溃疡的短期疗效观察［J］.口腔医学研究，2002，18（4）∶257-258　　［2］  李秉琦.口腔黏膜病学［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，2003∶49-57　　［3］  Savage NW,Mahanonda R,Seymour GJ, et al. The proportion of suppressor-inducer T-Lymphocytes is reduced in recurrent aphthous stomatitis ［J］. J Oral Pathol，1988,17(6)∶293-297　　［4］  许鸿生,王安训.35例复发性口腔溃疡患者T淋巴细胞亚群的研究［J］.新医学，1999,3(4)∶212　　［5］  曹明富，邵慧琴.茶多酚复合物抑癌及对细胞免疫功能的影响［J］.医学生物技术，1999，6(4)∶212-217　　［6］  曹明富,林植华，虞研原，等.茶多酚对细胞免疫功能的影响及抑瘤作用［J］.现代应用药学，1994，11(4)∶3-6　　［7］  朱茂祥，龚诒芬，杨陟华，等.茶对小鼠免疫功能的保护作用［J］.中华预防医学杂志，1998，32(5)∶271-274　　［8］  Yang CS, Lee MJ, Chen L. Human salivary tea catechin levels and catechin esterase activities:implication in human cancer prevention studies ［J］. Cancer Epidemiol Biomark  Prev, 1999, 8(1)∶83-89