组织工程技术构建下颌髁突的研究进展

作者：郑有华综述 张志光审校    作者单位：中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院口腔颌面外科 广东 广州 510055 【摘要】  髁突骨关节病和骨-软骨破坏是临床上常遇到的问题。组织工程学的兴起为髁突骨质缺损的修复提供了新的治疗途径和希望。虽然已经对下颌髁突进行了大量的研究，但组织工程技术构建髁突的研究仍处于早期探索阶段。本文对组织工程技术构建下颌髁突相关的细胞来源、支架材料和下颌髁突构建存在的问题等进行了综述。

【关键词】  组织工程； 下颌髁突； 间充质干细胞； 支架

    Advanced study of tissue engineering of mandibular condyle  ZHENG You-hua, ZHANG Zhi-guang. （Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, Guanghua College of Stomatology, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510055, China）

    [Abstract]  Osteoarthrosis or osteochondral tissue destroy of mandibular condyle are common diseases clinically. Tissue engineering provides a new way and the revolutionary possibility for curing these diseases. Although chara-

    cterization of the mandibular condyle has been extensively studied, tissue engineering of the mandibular condyle is

    still in an early stage. This review focuses on advanced study relevant to cell sources, scaffolds, tissue engineering regeneration and challenges for mandibular condyle tissue engineering.

    [Key words]  tissue engineering； mandibular condyle； mesenchymal stem cell； scaffold

    髁突骨关节病和骨-软骨破坏是临床上常遇到的问题。组织工程学的兴起为髁突骨质缺损的修复提供了新的治疗途径，但该领域的研究仍处于早期探索阶段，近10年来逐渐有少量文献报道采用组织工程方法构建髁突。本文对组织工程化下颌髁突相关的细胞来源、支架材料以及下颌髁突构建的有关问题综述如下。

    1  下颌髁突组织工程的细胞来源

    1．1  从骨、骨膜或关节软骨获取骨细胞和软骨细         胞许多组织工程研究选择从骨、骨膜或关节软骨获取成熟的骨细胞和软骨细胞修复骨和软骨组织。传统获取骨和软骨细胞的方法是酶消化法和组织块法[1-3]。利用已分化的软骨细胞和成骨细胞进行组织工程构建，可能存在几个问题：1）供区的损伤；2）大规模的组织工程构建需要高的初始细胞密度以获得足够的软骨和骨为临床应用，而关节来源的软骨细胞和成骨细胞很难满足要求[4]；3）体外培养扩增骨和软骨细胞，随着培养时间和传代数的增加会出现细胞分化[5]，这将导致软骨细胞表型的丧失、影响基质合成和蛋白多聚糖产量减少，而且合成胶原类型从Ⅱ型转变为Ⅰ型。然而，Darling等[5]的研究证明，单细胞培养中聚集蛋白聚糖（aggrecan）涂层的表面有能力维持软骨表型，使用水凝胶包被载体培育的软骨细胞能维持其表型和使已分化的软骨细胞再表达。

    1.2  从成体干细胞获取软骨细胞和成骨细胞

    近年来的研究表明，干细胞包括成体间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）和人脐带基质（human umbilical cord matrix，HUCM）干细胞，在添加特殊的生长因子后，具有多向分化成多细胞系的能力，可分化为软骨、骨、肌腱和其他结缔组织。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stemcell，BMSC）是目前首选的干细胞类型，能分化成软骨细胞和成骨细胞[6-7]，使得单细胞群来源的BMSC构建组织工程下颌髁突骨-软骨成为可能[8-9]。然而，MSC有其自限性，骨髓中MSC含量极少（约占骨髓有核细胞的0.001%～0.01%）[6]，随着年龄的增长能获取的细胞还会减少，而且供体部位会损伤。HUCM干细胞亦为多能干细胞，其特征介于ESC和MSC间，而且免疫排斥率低。Bailey等[10]的研究显示，HUCM干细胞能形成细胞外基质，包括Ⅰ型、Ⅱ型胶原和黏多糖（glycosamino-glycans，GAG），这表明HUCM干细胞有能力分化为软骨样细胞。将HUCM干细胞和髁突软骨细胞进行比较证明，HUCM干细胞产生的细胞量、胶原和GAG含量明显高于髁突软骨细胞，提示HUCM干细胞有构建下颌髁突软骨组织工程的可行性。

    2  下颌髁突组织工程的支架材料

    支架是组织工程构建的中心，为组织重建提供机械和结构支持，以及作为载体为细胞附着、游走、增殖和维持分化功能提供必要的支持。此外，支架的结构决定了新组织工程软骨和骨的最终形态[8]。目前用于构建骨-软骨组织工程的支架材料包括合成材料和自然材料。合成支架材料有聚羟基乙酸（polyglycolic acid，PGA）、聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚乙烯（polyethylene）、聚乙烯乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、聚己酸内酯（polycaprolactone，PCL）、羟磷灰石（hydro-xyapatite，HA）、β-磷酸三钙（tricalcium phospha-te，TCP）及其复合体。其复合体包括PGA/PLA、乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic a-cid，PLGA）和HA/TCP等[11-13]。这些合成支架材料的缺点是表面疏水，细胞黏附性相对较弱。自然支架材料包括胶原、纤维蛋白、壳聚糖和自然珊瑚等。这些自然支架材料能够改善细胞的附着。胶原是软骨的一种自然成分，胶原支架在细胞黏附、软骨细胞和细胞骨分化期间起重要作用。已有许多研究将合成生物材料加表面修饰以改善其黏附和生物相容性，如通过水凝胶包被和化学技术完成胶原涂层等[14]，来促进细胞在PLA和PLGA等支架上附着和矿化的基质沉积。

    最近出现的支架制作技术，如电纺锤快速成型（electrospinning rapid prototyping）、熔化沉积（fused deposition modeling，FDM）、选区激光烧结（selective laser sintering，SLS）[11]、自由实体制造（solid freeform fabrication，SFF）[12]和基于影像的设计（image-based design，IBD）方法，已用来制作复杂的能控制降解速度和特殊孔率的骨-软骨支架，以及准确控制支架的维度。随着纳米纤维支架材料的出现，可将纳米纤维形成非编织网以加强机械特性，如牵张力、弹性和渗透性，以及由于纳米纤维和固有的细胞外基质之间的相似性而加强细胞附着[8]。

    3  组织工程技术构建下颌髁突

    虽然近10年来逐渐有少量文献报道采用组织工程技术构建下颌髁突，但该领域的研究仍处于早期探索阶段。Weng等[15]最早进行组织工程技术构建下颌髁突的尝试，以可降解生物材料聚羟基乙酸/聚乳酸预制人下颌髁突模型支架，在支架上接种从牛骨膜上获取的体外培养的成骨细胞和从牛前肢关节软骨来源的软骨细胞涂在支架表面作为软骨层，植入裸鼠皮下，12周后发现支架维持髁突的形状，组织学观察有骨和软骨组织结构，两者之间形成连接有序的界面，骨组织内有大量新生骨板。该研究证明，使用已分化的自体细胞以两层分层的形式创建组织工程化下颌髁突是可行的。Ueki等[16]在行兔髁突切除术后，种植PLGA和凝胶海绵复合体，24周后可看到骨和软骨样组织生长，但是以这种方式再生的新组织是软骨和骨混合在一起，而不是软骨和骨位于两个分离层。Abukawa等[17]将成骨诱导的猪BMSC接种到下颌髁突形状的多孔PLGA支架内，在体外转动的生物反应器内培养6周，结果显示，整个PLGA支架表面有骨形成，平均厚度为0.03 mm。Chen等[18]将兔BMSC体外培养扩增，用重组人骨形成蛋白-2（recombinant human bone morphoge-netic protein-2，rhBMP-2）诱导为成骨细胞，然后接种到多孔的自然珊瑚支架上，植入裸鼠皮下，证明在髁突形状的支架内有新骨形成，而且支架维持最初的形状。Alhadlaq等[19-20]将鼠股骨和胫骨来源的MSC诱导分化为软骨细胞和成骨细胞，将这些成骨细胞和软骨细胞悬浮于以PEG为基础的水凝胶中，分两层分别接种于人下颌髁突形状的聚亚胺酯模型，然后光敏聚合；裸鼠体内种植8～12周后，组织学显示，骨和软骨两层结构，软骨样和成骨样组织相互渗透，软骨部分表达与软骨相关的GAG和Ⅱ型胶原，在骨－软骨连接部位表达典型肥大软骨细胞的Ⅹ型胶原；骨质部分含有小梁样骨结构，表达Ⅰ型胶原、骨桥素和骨连接素。这些研究的结果表明，从骨髓单细胞群来源的软骨细胞和骨细胞构建人下颌髁突形状的组织工程化下颌髁突是可能的。

    4  组织工程技术构建下颌髁突的问题和展望

    髁突软骨-骨的结构较为复杂，组织工程构建下颌髁突不是单纯的组织重建，而是涉及两个结构和功能明显不同而又整合的软骨和骨组织。目前组织工程化髁突与固有髁突的组织结构和机械性能仍有明显的不同。组织工程构建一个有功能的下颌髁突，需要考虑许多挑战。1）种子细胞的选择：包括自体已分化的骨细胞、软骨细胞和干细胞，一些研究使用MSC，而另一些选用分化的软骨细胞和骨细胞。2）生长因子：必须进一步研究生长因子对软骨细胞和骨细胞的作用机制，细胞对外源性生长因子的反应，生长因子的选择，细胞增殖和生物合成的最佳剂量等。3）支架材料的选择：有必要改善设计和制作骨－软骨支架的技术以制作多层复合体，在两层内应具有为软骨再生和骨形成的、可控制的物理和机械特性的空间分布。4）大块的人髁突骨、软骨构建过程如何保证支架内细胞团的营养和废物交换，达到所需的细胞密度和维持细胞的生存，以及构建的骨组织内的血管化。

    随着颞下颌关节组织工程的进展，以上问题将逐步得到解决。理想的是，根据临床影像资料预先确定制作具有理想孔率的既分层又整合的骨－软骨层三维支架，然后将体外培养扩增的软骨细胞和成骨细胞接种到支架上，构建具有功能的下颌髁突，所构建的下颌髁突不但具有骨－软骨形态结构，而且具有与下颌髁突固有组织相似的物理机械性能，这将为严重颞下颌骨关节病和骨软骨破坏的治疗带来新的希望。

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