核转录因子-κB受体活化因子及其配体和骨保护蛋白系统在骨构建与骨改建中的作用

核转录因子-κB受体活化因子及其配体和骨保护蛋白系统在骨构建与骨改建中的作用作者：刘莉综述 罗云，王敏审校    作者单位：四川大学华西口腔医院修复科 四川 成都 610041    【摘要】  核转录因子-κB受体活化因子配体（RANKL）-核转录因子-κB受体活化因子（RANK）-骨保护蛋白（OPG）系统是近年发现的调节骨吸收的关键信号通路。RANKL与RANK结合在正常骨构建与骨改建中调节破骨细胞生成、活化和存留，在多种病理状况下增加骨吸收。OPG与RANK竞争性地结合RANKL，以防止骨组织的过度吸收。笔者分别就RANKL、RANK和OPG及其在骨构建与骨改建中的作用作一综述。       【关键词】  骨吸收； 破骨细胞； 核转录因子-κB受体活化因子； 核转录因子-κB受体活化因子配体； 骨保护蛋白    ARegulation of receptor activator of nuclear factor-κB ligand-receptor activator of nuclear factor-κB and osteoprotegerin in bone modeling and remodeling  LIU Li, LUO Yun, WANG Min. （Dept. of Prosthodontics,West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）    [Abstract]  Receptor activator of nuclear factor-κB ligand（RANKL）-receptor activator of nuclear factor-κB（RANK）and osteoprotegerin（OPG） discovered in the mid 1990s is the key signaling system for the regulation of bone resorption.RANKL-RANK signaling regulates osteoclast formation, activation and survival in normal bone modeling and remodeling and increases bone resorption in a variety of pathologic conditions. OPG protects bone from excessive resorption by binding to RANKL and preventing it from binding to RANK. This article reviewed regulation of RANKL-RANK-OPG in bone modeling and remodeling.    [Key words]  bone resorption； osteoclast； receptor activator of nuclear factor-κB ligand；receptor activator of nuclear factor-κB； osteoprotegerin    骨保护蛋白（osteoprotegerin，OPG）具有对抗骨丢失的作用。以OPG为探针通过表达克隆发现了其核转录因子（nuclear factor，NF）-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL），在此之前研究人骨髓来源髓样树突状细胞cDNA文库发现的NF-κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）为RANKL的受体。Suda等[1-2]发现，绝经后女性的骨质疏松症与牙周病有一定的相关性。王敏等[3]发现，桡骨骨密度与下颌骨骨密度有一定的关系，与无牙颌牙槽骨吸收也有一定的关系。RANKL-RANK-OPG系统是近年发现的调节骨吸收的关键信号通路，RANKL与RANK结合在正常骨构建与骨改建中调节破骨细胞生成、活化和存留，在多种病理状况下增加骨吸收。OPG与RANK竞争性地结合RANKL，防止骨组织的过度吸收。随着OPG在防治骨质疏松症方面的深入研究，一些opg基因疗法及其蛋白疗法既能有效地对抗绝经后的骨质疏松，也能有效地缓解其牙槽骨吸收。1  RANKL    RANKL是成骨细胞和活化的T细胞中典型的同源三聚体膜连接蛋白，可由活化的T细胞等通过溶蛋白裂解或选择剪接的方式分泌，在淋巴结、胸腺、乳腺和肺组织中高表达，在脾和骨髓等组织中低表达。大多数已知刺激破骨细胞形成和活化的因子诱导髓样基质细胞表达RANKL。关节炎关节中的滑膜细胞和活化的T细胞表达RANKL，并与白细胞介素（interleukin，IL）-1、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）一起促进破骨细胞前体融合形成破骨细胞，引起一定程度的关节破坏。RANKL还可刺激破骨细胞前体进入血液循环。在RANKL诱导下，破骨细胞的活化把骨重建和造血作用的调节联系在一起[4]。Kim等[5]发现，RANKL信号在肿瘤细胞移行和骨转移中起作用。    Sobacchi等[6]报道的加拿大一原著民家族人类rankl基因突变的病例，患者无明显的T、B细胞数量减少和频繁感染等免疫指标异常，也没有像rankl－/－小鼠样地表现出淋巴结缺失和泌乳功能丧失。其原因，可能系人与鼠的种属差异或患者体内变异的RANKL蛋白通过某些方式调节了其免疫功能，也可能是某些免疫缺陷尚未表现。2  RANK    RANK属同源三聚体跨膜蛋白TNF受体超家族成员，除破骨细胞前体、成熟的破骨细胞和树突细胞之外，乳腺和易于骨转移的乳腺癌及前列腺癌的癌细胞也表达RANK[5]。迄今，尚未在骨硬化症患者中检测出rank基因的突变。偶有转基因小鼠自发rank基因缺失突变的报道，其特征与定向敲除rank基因小鼠完全一致，发生骨硬化[7]。一些家族性畸形性骨炎患者伴有rank基因外显子-1的活化突变，破骨细胞生成和活性增加，表现出溶骨作用。RANK对破骨细胞生成具有重要作用[8]，RANK在肿瘤细胞增殖中的潜能使其可能成为将来抗肿瘤治疗的新靶点[5]。3  OPG    OPG含有380个氨基酸，是一种分泌型糖蛋白和缺乏跨膜结构域的TNF受体家族成员，由成骨细胞分泌，在心、肝、肾和脾组织中表达。Li等[9]发现，骨髓中64%的OPG来源于B细胞，B细胞缺失小鼠全部发生骨质疏松。多种细胞因子、激素、生长因子和Wnt糖蛋白/β-连环蛋白调节成骨细胞中OPG的表达。    青少年畸形性骨炎患者伴有opg基因纯合子部分缺失，骨重建增加、骨量减少。一些原发性血磷钙酯酶过多的患者，其opg基因外显子-3钝化缺失，表现出骨循环增加、长骨畸形、驼背和髋臼突出[10]，从侧面证明了OPG的骨保护作用。    opg基因敲除小鼠致OPG缺乏，在小鼠成熟前即出现严重的骨质疏松和大动脉钙化，说明OPG可防止大血管钙化。有关OPG和RANKL对心血管疾病的作用仍有争议，比如在高血压合并心衰、慢性肾功能衰竭等患者的血清中，OPG水平升高；但在肾功能衰竭和继发甲状旁腺功能亢进的患者中，OPG似乎并未保护骨组织对抗增加的骨吸收[11]。4  RANKL-RANK-OPG对破骨细胞形成与活化的调节    破骨细胞是来源于血源性的并进行骨吸收的功能细胞，其原细胞骨髓粒细胞-单核细胞集落生成单位在骨髓基质细胞合成分泌的巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）刺激下分化生成破骨细胞前体[12]。骨骼硬化症小鼠（op/op mice）不表达有效的M-CSF，缺乏破骨细胞，表现出骨硬化[13]。    破骨细胞前体的分化由RANKL和RANK相互作用活化的多种转录因子和信号通路调节。RANKL促进破骨细胞前体分化需要先后表达NF-κB、原癌基因fos编码的糖蛋白（c-Fos）和特定的调节激活T细胞核因子转录因子NFATc1[14]。TNF与RANKL能直接使野生型破骨细胞前体向破骨细胞分化并且生成NF-κB、c-Fos和NFATc1[14]。TNF还能在rankl－/－和rank－/－小鼠体内间接通过自身或其他因子诱导成骨细胞生成RANKL来促进形成破骨细胞[15]。在RANKL和TNF激活的通路中，破骨细胞前体内c-Fos或NFATc1可代替NF-κB，当其高表达时，IL-1可直接诱导破骨细胞形成[14]。通过这种机制，炎症骨组织中IL-1水平升高，直接诱导使破骨细胞数目增加，并增强上述细胞因子诱导破骨细胞生成的作用。    被激活的破骨细胞贴附骨质一侧的细胞膜形成皱褶缘，表面积增加，通过整联蛋白与骨基质紧密结合，经胞吐作用分泌的氢离子、金属基质蛋白酶、酸性磷酸酶和其他蛋白水解酶溶解骨基质[12]。RANKL与破骨细胞前体表达的树突细胞-特异性跨膜蛋白（dendritic cell-specific transmem-brane protein，DC-STAMP）和破骨细胞质子泵亚单位Atp6v0d2一起促进破骨细胞前体互相融合，也通过NFATc1诱导抗酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K的表达。5  RANKL和RANK在破骨细胞前体及破骨细    胞中激活的信号分子RANK没有内在性蛋白激酶活化介导信号传递，RANKL与RANK结合后，肿瘤坏死因子受体相关因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）与RANK细胞质侧特殊位点结合并传递信息。TRAF-2、5、6均与RANK相连，但只有TRAF-6在破骨细胞前体和破骨细胞中有重要作用[16]。两组研究发现，TRAF-6缺失小鼠出现骨硬化，一组小鼠破骨细胞数目正常，未被活化，一组无破骨细胞生成[17-18]。RANK和TRAF介导的NF-κB激酶抑制剂（inhibitor of NF-κB kinase，IKK）/NF-κB、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-termi-anl kinase，JNK）/激活蛋白-1（AP-1）、c-myc、钙调磷蛋白磷酸酶/NFATc1等蛋白激酶信号激活通路直接诱导破骨细胞形成，Src、MMK-6/p38/MITF介导破骨细胞的活化，Src、细胞外信号调节激酶调控破骨细胞的存活[19]。    磷酸化的酪氨酸残基蛋白家族中的Grb相关结合蛋白（Gab）-2和含有src编码的酪氨酸蛋白激酶区同源结构2（SH2）的补充信号分子，两者与TRAF一起连接于RANK细胞质侧结构域。gab-2缺失小鼠中的RANK诱导破骨细胞的形成和分化降低，骨吸收降低，表现出轻微的骨硬化，提示Gab-2在破骨细胞分化中不起决定性作用[20]。    NF-κB、AP-1和NFATc1在破骨细胞形成中起重要作用。NF-κB p50/p52敲除的破骨细胞前体不表达RANKL，在外源M-CSF作用下过表达c-Fos，对抗破骨细胞形成障碍[14]。在fos－/－破骨细胞前体中，过表达NFATc1可对抗其分化障碍[21]。RANKL信号活化c-Fos需要表达NF-κB p50和p52，提示c-Fos和NFATc1位于NF-κB信号通路的下游[14]。以上研究说明，NFATc1是破骨细胞形成的主要调节因子。被RANKL活化的c-Fos和RNA聚合酶Ⅱ等也参与NFATc1的正向调节。环孢素和钙调磷蛋白磷酸酶抑制剂抑制NFATc1的活性，但是经过环孢素治疗的患者仍然表现出骨丢失。osterix是一种调节成骨细胞分化和功能的转录因子，NFATc1正性调节其表达。因此，环孢素诱导的生物体内骨丢失可能是其对成骨有更大的抑制作用[22]。    差示筛选人类破骨细胞cDNA文库发现，G-蛋白信号（RGS）-10调节剂在破骨细胞特异性表达[23]。在破骨细胞前体中，RANKL诱导的RGS-10异位表达增加破骨细胞对RANKL信号的敏感性。研究表明，RGS-10特异性调节在破骨细胞分化中RANKL诱发的RGS-10/钙调蛋白-钙离子振动-钙调磷蛋白磷酸酶-NFATc1信号通路，可能成为骨吸收增加的骨疾病的潜在治疗位点。6  RANKL-RANK-OPG在骨构建中的作用    骨构建是指骨表面的组织间隙单方向运动，引起骨几何形态、大小和骨量的改变，这在发育的骨中十分显著。哺乳动物除颅骨外的多数骨为软骨内成骨[12]。软骨内骨化需要间质成骨细胞前体表达骨形成的核心结合因子（core binding factor，Cbf）-α1。Cbf-α1缺失，血管不会长入软骨，不能形成骨组织。Cbf-α1还介导成骨细胞辨别骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2[24]，从而调节软骨细胞的分化和通过NF-κB依赖方式调节骨的形成[25]。    肥大的软骨细胞和肥大的软骨细胞前体可表达RANKL、RANK和OPG。RANKL、RANK以及NF-κB p50和p52缺失小鼠缺乏破骨细胞，生长板肥大的软骨细胞区增厚，出现骨硬化现象。有关RANKL、RANK和NF-κB信号在软骨内成骨的作用仍不清楚，也许通过NF-κB p50和p52调节的基因至少暂时调节肥大的软骨细胞的存活时间[26]。    生长区肥大的软骨细胞与破骨细胞前体的分化有关，BMP-2和胆骨化醇剂量依赖性地正性调节这两种细胞表达的RANKL[27]。软骨细胞与成骨细胞相似，也表达OPG，但在BMP-2作用下表达剂量不及RANKL，RANKL和OPG比例的改变，有利于破骨细胞的分化。体内软骨细胞持续表达RANKL并可在体外诱导破骨细胞前体分化形成破骨细胞。在胚胎期和新生期2个月内，骨生长非常迅速，生长板中破骨细胞形成，快速吸收骨基质并形成骨髓腔。肥大的软骨细胞还分泌血管内皮生长因子和其他能调节血管生长的因子，通过RANKL促进新生血管中破骨细胞前体活化[26]。RANKL对外周血单核系细胞有化学吸引作用，因此软骨细胞局部释放和BMP-2诱导产生的RANKL可调节破骨细胞前体活化。在软骨吸收的骨形成过程中没有破骨细胞参与，也许软骨吸收由破软骨细胞完成，其可能来源于单核系[26]。7  RANKL-RANK-OPG在骨重建中的作用    骨重建指破骨细胞在已形成的骨小梁和骨密质侵蚀形成小腔，成骨细胞随后填入小腔并分泌新的基质骨，骨吸收持续进行而新骨不断沉积地循环[12]。正常消耗引起部分骨损伤，因身体形态和质量变化或锻炼引起的机械力的改变，全身激素改变引起的局部细胞因子或生长因子的释放等都可促进骨重建，但其过程尚不完全清楚。    机械力在一定程度上影响骨细胞，使之诱导微环境中的成骨细胞表达RANKL，从而调节破骨细胞募集于骨吸收部位[28]。成骨细胞最终被骨基质包埋形成骨细胞，骨细胞本身不表达RANKL，但可通过骨基质表面的成骨细胞和骨髓腔里的成骨细胞相互传递信息，调节RANKL的表达。    在类风湿性关节炎、绝经后妇女骨质疏松症、甲状旁腺功能亢进等多种病理情况下，骨重建的部位速率增加。局部和（或）全身激素水平改变或致炎因子刺激骨吸收。大多数因子通过成骨细胞和其他细胞表达M-CSF和RANKL的间接机制显著诱导骨吸收。最新的研究表明，破骨细胞也具有正负性调节成骨细胞的功能，介导造血干细胞从骨髓腔到血液在病理情况下发挥免疫调节作用[4]。8  与OPG有关的药物    在性激素缺乏、糖皮质激素诱导的骨质疏松症、类风湿性关节炎、多发性骨髓瘤和代谢性骨病的模型中，OPG抑制骨丢失[29]。有研究者在OPG融合蛋白一期临床试验中发现，自愿者骨吸收的生化指标呈现出长期性OPG剂量依赖性降低。但可能因其免疫反应和对免疫系统未知的副作用，随后停止了该临床试验。Denosumab是在小鼠中注射人RANKL得来的人单克隆抗体。与OPG相似，Denosumab与RANKL结合并使之失活。Denosumab与OPG融合蛋白相比较，半衰期更长且血清中骨吸收和形成的标志物降低的时间延长[30]。Denosumab在临床Ⅱ、Ⅲ期试验中对骨吸收的抑制作用明显，但未发现明显的副作用。【参考文献】[1] Suda T, Takahashi N, Udagawa N, et al. 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