胶原基纳米骨的遗传毒性及对体外培养细胞影响的研究

胶原基纳米骨的遗传毒性及对体外培养细胞影响的研究作者：陈鹏　毛天球　刘冰　岳进　雷德林　杨耀武 　　［摘要］  目的：体外研究胶原基纳米骨的遗传毒性，及对原代培养的人牙周膜成纤维样细胞、兔成骨细胞的影响。方法：采用Ames致突变试验、MTT法及碱性磷酸酶（ALP）检测法，测定不同浓度胶原基纳米骨(nHAC)的浸提液对鼠伤寒沙门菌的致突变比值的影响和对人牙周膜成纤维样细胞及兔成骨细胞的影响。结果：nHAC的浸提液各剂量组对鼠伤寒沙门菌的致突变比值均小于2，nHAC不会引起鼠伤寒沙门菌的回复突变数增加。不同时间点用不同浓度浸提液培养的人牙周膜成纤维样细胞正常增殖，浸提液不影响兔成骨细胞的功能表达。结论：胶原基纳米骨无遗传毒性，不影响人牙周膜成纤维样细胞的增殖活性和兔成骨细胞的成骨活性，是一种组织工程骨支架的良好材料。　　［关键词］  纳米  生物材料  胶原基纳米骨  遗传毒性　　Genetoxicity of Collagen Based Composite and Its Influence on Cultured Cell in Vitro. CHEN Peng, MAO Tian-qiu, LIU Bing, et al. Stomatlogical College, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032　　［Abstract］Objective: To study the genetoxicity of nano-hydroxyapatite/collogen (nHAC) in vitro and the influence on primary cultured human periodontal ligament fibroblast-like cells(PDLF) and rabbit osteoblasts by nHAC. Methods: The Ames test, MTT assay and alkaline phosphatase(ALP) activity test were carried out to evaluate the influence on the mutagenesis rates of murine typhoid salmonella, on the PDLF and rabbit osteoblasts by different density nHAC leaching liquid. Results: The mutagenesis rates of murine typhoid salmonella in the experimental groups of all dosage levers were less then 2, and nHAC would not cause the increase of the back mutation in murine typhoid salmonella. The PDLF proliferation rate was normal in the infusion compared to standard DMEM culture medium. Infusion had no effects on the functional expression of rabbit osteoblasts. Conclution: nHAC has not the inherited toxicity, and induces no cytotoxicity effect on the activity of PDLF and osteoblasts. It can be used as a tissue engineering scaffold.　　［Key words］  Nanometer  Biomaterials  Collagen based composite  Genetoxic     近年来利用各种材料的优缺点将多个材料进行复合，制作具有更好的生物兼容性、骨引导性、可吸收性及强度的支架材料是骨组织工程的研究热点之一。清华大学材料科学与工程系最新研制的多孔块状胶原基纳米骨（nano-hydroxyapatite/collogen，nHAC）是目前各项性能较好的复合材料之一［1］，本实验试图进一步研究nHAC的遗传学毒性及对人牙周膜成纤维样细胞、兔成骨细胞的影响，为其在口腔颌面外科的临床应用提供实验基础。1  材料与方法　　1.1  主要仪器与材料  超净台（苏州医疗设备厂）；相差显微镜(Olympus)；酶联免疫检测仪（华东电子管厂）；DMEM(Gibco)；胎牛血清(杭州四季清，经灭活后使用)；噻唑蓝(MTT )、二甲基亚砜（DMSO）、谷胺酰胺、胰蛋白酶、地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C（Sigma）；碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；苯酚 (西安化学制剂有限公司，分析纯)；组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌株TA98、TAl00（陕西省卫生防疫站提供）；叠氮化纳(SA)、2-氨基芴(2-AF) （Sigma）。　　1.2  浸提液的制备　　1.2.1  制备用于Ames致突变试验的浸提液  取4片直径8 mm,厚0.5 mm的圆盘状nHAC于小烧杯中，加人生理盐水20 mL，以锡纸封口，置37 ℃恒温水浴内浸泡72 h制备材料浸提液，24 h内进行试验。　　1.2.2  制备用于细胞学实验的浸提液  浸提介质为细胞培养液（新鲜配制，pH=7.2）。按照nHAC重量/浸提介质＝1 g/10 mL比例配制，37 ℃，5%CO2 饱和湿度孵箱中浸提48 h待用。　　1.3  Ames致突变试验  将材料浸提液用生理盐水按原液，1/2，1/4，1/8的系列浓度稀释成待测液。用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型TA98，TAl00为指示菌株；大鼠肝脏微粒体酶系(S9)由多氨联苯诱导，制成肝匀浆后-80 ℃冰箱内保存，使用时用2-氨基芴测定其活力，将柔毛霉素配成25 μg/0.1 mL，将2-氨基芴(2-AF)配成50 μg/0.1 mL，将叠氮化钠(SA)配成5 μg/0.1 mL，用于阳性对照，其中柔毛霉素、SA分别作为TA98和TAl00的直接致突变活性指示(不加S9)，2-AF作为TA98和TAl00的间接致突变活性指示(加S9)；以同样体积生理盐水作为阴性对照。阳性对照、阴性对照及待测液各剂量组均各设3个平行皿。采用平板掺入法，在加S9和不加S9条件下进行，经37 ℃培养48 h后观察结果。每组取3个平行皿的平均回变菌落数。测试结果以致突变比值( MR＝实验组回变菌落数Rt/阴性对照组回变菌落数Rc)表示。　　1.4  细胞培养  选用两种细胞，一种是原代培养人牙周膜成纤维样细胞（PDLF）：取18~28岁患者的健康正畸牙，无菌环境下，用Hanks液冲洗3遍，刮除牙根中1/3的牙周膜组织，分离成1 mm3大小的组织块，平整地铺在培养瓶瓶底，组织块之间间隔约0.5 cm，于37 ℃，5% CO2的培养箱中倒置2 h，等组织块微微干涸后，再加入2 mL的培养液进行培养，待有细胞长出后，每隔3 d换液，待细胞长满后，用胰酶消化，进行传代，取第5代细胞待用。另一种是兔成骨细胞：出生1个月的新西兰幼兔1只，断头处死，无菌条件下取四肢长骨，纵行切开，用DMEM培养液冲洗骨髓腔，轻轻吹打，静置1 min，使大块组织沉降，取上清进行培养，培养液为含10%胎牛血清的DMEM培养液，待细胞汇合成单层后，0.25%的胰蛋白酶常规消化、传代，将传代细胞加入条件培养基（DMEM完全培养基中加入地塞米松 1×10-8 mol/L、β-甘油磷酸钠 10 mmol/L、维生素C 50 mg/L）继续培养，使骨髓基质细胞转化为成骨细胞。　　1.5  材料对人牙周膜成纤维样细胞增殖率的影响  牙周膜成纤维样细胞制备成5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中。培养板置于培养箱中继续培养24 h，使细胞贴壁。弃去原培养液，将nHAC材料浸提液用细胞维持液按原液，1/2，1/4，1/8的系列浓度稀释成实验组，阴性对照组用新鲜的细胞维持液来替代，100 μL/孔。设8个平行样，继续培养2、4、7 d；加入5 mg/mL的MTT，50 μL/孔，继续培养2 h后中止，用PBS清洗2遍后，弃去孔内液，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL孔，轻轻震荡10~15 min，测定其吸光度值(A)，测试波长为490 nm。计算细胞相对增殖率(relativegrowth rate，RGR)：nHAC的RGR=实验组A均值/阴性对照组A均值×100%。　　1.6  材料对兔成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性的影响  将兔成骨细胞按浓度1×106/mL接种到96孔板中，每孔接种细胞悬液200 μL。阳性对照为6.4 mL/L苯酚，阴性对照为细胞培养液。细胞贴壁24 h后，移去上清。取上述实验组分别加入200 μL，37 ℃，5%CO2环境中培养。按照测定孔、标准孔、空白孔分组，测定孔中加入浸提液原液5 μL，标准孔加入0.1 mg/mL 酚标准液5 μL，空白孔加入双蒸水5 μL。再分别加入缓冲液50 μL，基质液50 μL，充分混匀后37 ℃水浴15 min，再分别加入显色剂150 μL，立即混匀，酶联免疫检测仪520 nm波长下测定各孔光吸收值（OD值，用空白管调零）重复3遍。100 mL血清在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg酚为一个金氏单位。计算公式：　　表1  Ames致突变试验结果　略　　1.7  统计学方法  使用SPSS 10.0统计软件进行数据分析。2  结果 　　2.1  各组回变菌落数见表1。各浓度待测液实验组的MR1，1/2，1/4，1/8＝Rt1,1/2,1/4,1/8/Rc均小于2，各阳性对照组MRp＝Rp/Rc均大于2。　　2.2  牙周膜成纤维样细胞在实验组及阴性对照组的RGR值见表2。　　2.3  成骨细胞在实验组及阴性对照组的碱性磷酸酶活性值见表3。　　表2  nHAC中人牙周膜成纤维样细胞的RGR　略　　表3  碱性磷酸酶活性测定值　略    随着培养时间的延长，两组细胞ALP含量都有所增加。比较相同时间点两组间ALP含量，统计学无显著差异(P＞0.05)。3  讨论    胶原基纳米骨材料是通过自组装的方法，采用提纯并去抗原的Ⅰ型胶原为范本，在钙-磷盐溶液中调制矿化而获得的复合材料，矿物相为含有碳酸根的羟基磷灰石，晶粒度低，晶体尺寸在纳米量级，且与胶原自组装为分级结构。此材料孔隙率70%，孔隙大小100 μm左右，在成份和结构上都与天然骨具有较大的相似性。材料的多孔结构使细胞易于长入，而营养物质也易于运输。材料具有优良的生物兼容性和生物可降解性［2，3］。纳米级的晶体比表面积大，易于吸收，而胶原与之同时被降解，降解产物对体内微环境没有不良影响，其可以模拟天然骨本身的新陈代谢，有利于新骨形成。而普通羟基磷灰石骨替代材料晶体尺寸较大，较难被破骨细胞吸收、降解，长时间植入体内也难以被吸收、替代［4~6］。    Ames致突变试验应用的是鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株(TAhis-)。该菌株在缺乏组氨酸的培养基上，只有发生自发回变的少数菌落才能生长。而经受试物诱变后，回复突变增多，从而表现为在缺乏组氨酸的培养基上生长的菌落数大大增加。基于该菌株的这一特性，将nHAC浸提液与各标准菌液混合后在最低营养板上培养，依据出现的回变菌落数来判断复合人工骨中是否存在诱变物质［7］。由于本实验所研究的nHAC是用于人体内植入的，所以人体肝细胞微粒体酶系就有可能启动该材料的诱变作用(间接诱变作用)，而细菌体内无此酶系。为使实验条件更接近体内环境，从而使得实验结果更实用性，我们在非活化实验后对材料浸提液中再加入大鼠肝细胞微粒体酶系S9进行活化实验，观察诱发后回变菌落数有无增加。另外，我们在观察结果时，首先观察背景菌苔的生长情况，只有背景菌落与阴性对照差不多，且排除杂菌污染后，所看见的菌落才是回变菌落，进而保证本试验结果的可靠性。本试验结果显示，阳性对照组各菌株回变菌落平均数均超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的2倍以上(MRp>2)，证实鼠伤寒沙门氏菌的组氨酸营养缺陷型突变菌株对受试物的检测有效；而各菌株每剂量组回变菌落平均数均未超过其相应阴性对照组回变菌落平均数的2倍(MR<2)，显示该材料在有、无S9的情况下均无诱变活性，说明nHAC用于体内植入在遗传毒性方面是安全的。    浸提液与植入部位的主要功能细胞(牙周膜成纤维样细胞、成骨细胞)作用，不仅反映材料的毒性，同时可以反映出材料对牙周膜成纤维样细胞增殖；成骨细胞增殖、分化等功能的影响。而碱性磷酸酶是成骨细胞分化的主要特征酶之一，对碱性磷酸酶活性的检测是鉴定成骨细胞和评价其功能活性的重要指针之一。由于检测指标更具材料特异性，因此实验结果对材料的临床应用具有更为真实可靠的参考价值。本实验结果表明用不同浓度nHAC浸提液作用后的牙周膜成纤维样细胞的增殖率无下降，从数值上看，增殖率似乎还有所上升，考虑原因可能是nHAC中的胶原成分具有一定的促进细胞黏附、增殖活性，其具体机理还有待于进一步研究。同时nHAC的浸提液亦不影响兔成骨细胞的功能表达。    从本实验可以看出，纳米羟基磷灰石复合胶原材料无潜在的遗传毒性，对牙周膜成纤维细胞，成骨细胞增殖、分化无抑制作用，将会是一种应用于口腔颌面外科的良好的植骨及骨组织工程支架材料。参考文献　　［1］  廖素三，崔福斋，张 伟.组织工程中胶原基纳米骨复合材料的研制［J］.中国医学科学院学报，2003，25(1)∶36-38　　［2］  Du C, Cui FZ, Feng QL, et al. Tissue response to nano-hydroxyapatite/collagen composite implants in marrow cavity ［J］. J Biomed Mater Res,1998,42(4)∶540-548　　［3］  Du C, Cui FZ, Zhang W, et al. Formation of calcium phosphate/collagen composites through mineralization of collagen matrix ［J］. J Biomed Mater Res, 2000, 50(4)∶518-527　　［4］  Tracy BM, Doremus RH. Direct electron microscopy studies of the bone-hydroxylapatite interface ［J］. J Biomed Mater Res, 1984, 18(7)∶719-726　　［5］  Gross U, Strunz V. The interface of various glasses and glass ceramics with a bony implantation bed ［J］. J Biomed Mater Res, 1985, 19(3)∶251-271　　［6］  孙皓. 羟基磷灰石修复颌骨囊肿术后骨腔及牙周骨缺损［J］.口腔医学研究，1999，15(2)∶123　　［7］  万伯建主编．遗传毒理学基础知识［M］．北京：科学出版社，1987