人口腔癌细胞系的建立

作者：冯元勇作者单位：青岛大学医学院附属医院口腔颌面外科，山东 青岛 266003《青岛大学医学院学报》2007年2月43卷1期 综述【关键词】  口腔肿瘤 细胞系 综述    到目前为止，口腔颌面恶性肿瘤病人的5年生存率已达65％左右，其中，口腔癌细胞系的建立和应用起了不可忽视的作用。这些细胞系为体外和体内研究肿瘤的生物学特性、诊断、治疗提供了有形的载体，它涉及到肿瘤的放疗、化疗、免疫治疗、基因治疗等各个方面的基础和临床前研究。继1981年我国首次建立第一株人口腔癌细胞系Tca8113之后［1］，20余年来我国相继建立了20余株口腔癌细胞系。本文就已建立的口腔癌细胞系和其主要生物学特点做一综述。    1  国内已建立的口腔癌细胞系及其特点    1.1  国内建立的细胞系    继人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113建立以来，国内建立的细胞系还有人颊黏膜鳞癌BCaCD885、腭腺样囊性癌ACC2、腮腺腺样囊性癌ACC3、舌下腺腺样囊性癌SACC83、腭黏液表皮样癌MEC1、人小涎腺腺样囊性癌NACC细胞系、人牙龈癌颈淋巴结转移细胞系GNM及舌鳞癌细胞系TSCCa［2］,以及与上述细胞系相关的6株高转移细胞系和3株耐化疗药物的细胞系。此外还建立了来源于嚼槟榔而无吸烟史者右颊黏膜鳞癌细胞系OC3［3］，腭黏膜黑色素瘤细胞系ME［4］，等等。    1.2  国内建立的常用细胞系的生物学特征    1.2.1  Tca8113细胞系系列  Tca8113细胞系来源于人舌鳞状细胞癌，由上海第二医科大学附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室何荣根等［1］建立，至今已有23年，该细胞系生长稳定，初建系时群体倍增时间为38.8 h，分裂指数高峰值为61‰，平板集落形成率为86.0％；染色体多数稳定在66条，为亚三倍体，有M1标记的染色体，连续传代仍保留此有价值标记的染色体；接种于兔抗小鼠胸腺细胞血清ATS处理的C57BL和ICR小鼠皮下，成瘤率为100％。周晓健等［5］在此细胞系的基础上建立了对顺铂（CDDP）耐药的细胞系Tca8113/CDDP，耐顺铂的剂量为9.2 mg/L。张建国等［6］建立了耐长春新碱细胞系Tca8113/V100，耐长春新碱剂量为100 μmol/L。第四军医大学口腔医学院吴军正等［7］于1999年通过裸鼠尾静脉注射Tca8113细胞，取一有神经症状的裸鼠脑组织原代培养，建成了高转移的细胞系Tb，该细胞染色体多数为66条，裸鼠皮下接种成瘤率100％；与Tca8113细胞相比，Tb细胞中线粒体更发达，分泌颗粒多，S期细胞百分比高，群体倍增时间短，软琼脂克隆形成率高，在裸鼠体内的实验性肺转移能力明显提高。又通过裸鼠舌黏膜下注射Tb细胞，取颈淋巴结转移灶建成细胞系TbTl，又将TbTl细胞经裸鼠尾静脉注射，取发现截瘫的裸鼠脊髓培养，建成了舌鳞癌脊髓转移细胞系Ts，该细胞染色体多数为60条，裸鼠皮下接种成瘤率为100％；与Tb细胞相比，Ts细胞群体倍增时间短，S期细胞百分比高，软琼脂克隆形成率高。   1.2.2  BCaCD885细胞系  人颊黏膜鳞状细胞癌细胞系，由华西医科大学口腔医学院廖小宜等［8］于1990年建立。该细胞系贴壁率高，2 h达83％；分裂指数高峰值为79‰；群体倍增时间为40.5 h；半固体琼脂培养克隆形成率为29.8％；平板集落形成率为10.3％；染色体多数为亚三倍体，有染色体畸变和15种异常染色体，其有价值的标记染色体为Inc7q；裸鼠皮下接种成瘤率为100％。    1.2.3  MEC1细胞系系列  人黏液表皮样癌细胞系MEC1，来源于腭部，由第四军医大学口腔医学院司徒镇强等于1990年建立。该细胞系在4 h贴壁率为86.9％，群体倍增时间约30 h，分裂指数高峰值为27‰；染色体为亚二倍体，44～46条；鼠抗人角蛋白抗体染色阳性，兔抗人分泌片（Sc）抗体和兔抗人溶菌酶抗体染色均阳性；细胞为单层生长，铺满瓶底后出现漂浮细胞，少见有重叠生长现象。该课题组在MEC1细胞系的基础上建立了耐药细胞系MEC1/FU，耐FU剂量为1.980 μg/L，与MEC1相比，该细胞系增殖略快，软琼脂克隆形成率明显提高，S期细胞增多，部分解释了其耐药性产生的基础。该课题组又通过裸鼠尾静脉注射MEC1，筛选出高转移细胞克隆Mc3，与其母本细胞MEC1比较，Mc3具有生长较快，S期细胞比例较高，接触抑制力下降（饱和密度高），在软琼脂内克隆形成率高，野生型P53蛋白表达阳性率低，裸鼠实验性肺转移率高等生物学特点，表明Mc3是一个高转移细胞株。该课题组用Mc3细胞经裸鼠涎腺移植，鼠间原位移植后获得转移力提高的M3SP2细胞系。杨宏林等将Mc3经尾静脉注射获得截瘫的裸鼠，取其脊髓培养，建立了细胞系Ms，与Mc3相比，Ms增殖速度和克隆形成率均较高，但裸鼠皮下接种成瘤速度慢。

    1.2.4  SACC83细胞系  人涎腺腺样囊性癌细胞系，来源于左舌下腺，由北京大学口腔医学院李盛琳等［9］于1987年建立。该细胞高峰期分裂指数为44‰；染色体多数为98～100条，为亚四倍体；裸鼠皮下接种成瘤率为100％,以浓度5×108/L接种该细胞，于2个月时成瘤，这与腺样囊性癌转移、复发所需时间较其他肿瘤长的临床观察一致。该细胞电镜下观察主要由两种细胞组成，即闰管细胞和分泌细胞，有丰富的染色质和细胞器。此后，应用该细胞又建立了人涎腺腺样囊性癌肺高转移细胞系SACCLM。

    1.2.5  ACC2、ACC3细胞系  腺样囊性癌细胞系，为肺低转移细胞系,由上海第二医科大学附属第九人民医院口腔颌面外科何荣根等［10］于1988年建立。ACC2来源于右腭部小涎腺，ACC3源自右腮腺，苏木精伊红染色细胞呈印戒状，裸鼠皮下成瘤率为100%。细胞角蛋白（CK）染色阳性证明该细胞有上皮源性细胞的特征；细胞黏液组织化学反应表明细胞内有对淀粉酶消化抵抗的PAS和阿辛蓝染色阳性的黏蛋白颗粒；电镜下细胞浆内有张力原纤维和丰富的分泌颗粒，细胞间有桥粒连接，证实了腺样囊性癌起源于一种多能储备干细胞的观点，该癌细胞在体外培养分化程度下降。关晓峰等［11］在ACC2的基础上建立了肺高转移细胞系ACCM，该细胞实验性肺转移率为96％。

    1.2.6  NACC细胞系  人小涎腺腺样囊性癌细胞系，来源于腭部，由农晓琳等［12］建立。该细胞系含有多种形态的细胞，方块形细胞可能为闰管细胞，类梭形细胞为肌上皮细胞，核大、细胞质及细胞器少的可能为未分化多能干细胞。该细胞4 h贴壁率为70％，高峰期分裂指数为6.8％，染色体为68～70条，亚三倍体占90％以上，这与SACC83细胞系亚四倍体不同。裸鼠皮下接种成瘤率为100％。培养中可见分泌黏液样物质，免疫组化结果符合肿瘤性肌上皮细胞特性。NACC细胞系为不同分化程度和发育周期的癌细胞所组成的细胞群体。

    2  国外建立且常用的部分细胞系

    国外常用的细胞系以日本建立者居多，其与国内建立的细胞系生物学特性相似。见表1。

    3  人口腔癌细胞系的共同特点

    各种细胞系生长稳定，连续长期传代其生物学行为变化不大，与人体内肿瘤组织有相似或相同的生物学行为。上皮样癌细胞电镜下均有细胞桥粒、张力原纤维和角蛋白束。腺样囊性癌细胞有较强的分泌及合成功能，培养观察到其可分泌黏液样的物质，腺样囊性癌源于多能干细胞，由闰管细胞、分泌细胞、肌上皮细胞、多潜能干细胞组成,为由分化程度不一致和处在细胞个体发育周期不同阶段的细胞组成的非均质体。黏液表皮样癌具有上皮和黏液细胞癌两者的特点。

    绝大部分口腔癌细胞系均能在裸鼠皮下接种成瘤，筛选到转移性细胞系的成瘤时间较母本细胞明显缩短［7，11］。但是文献报道肿瘤的原代培养成功率低于30%，而建立一个永生化的稳定传代的细胞系其成功率仅为1%。李金荣等改进了建系的方法，将人口腔癌组织在裸鼠体内连续接种传代后，提高了瘤体中细胞的纯度和体外适应能力，然后再进行组织块原代培养，易于建系。文献分析了381例肿瘤的裸鼠移植规律，发现人癌手术标本裸鼠异种移植的成功率为28.3%，其中复发性肿瘤移植成功率为50.0%，转移性肿瘤表1  国外建立且常用的部分细胞系缩写名称和（或）来源建系者或保藏机构HSC2人口底癌细胞系日本国立癌研究中心HSC3、HSC4人舌癌细胞系OSC2、4、5、6口腔癌细胞系日本高知医科大学AW13516、8507舌鳞癌细胞系TATAKE等［13］AW10498下牙槽骨鳞癌细胞系AW9803磨牙后三角鳞癌细胞系HO1N1颊癌细胞系 Ca922牙龈癌细胞系H1下牙龈癌细胞系HARADA等［14］NOS1下牙龈癌细胞系JI等［15］MSCC1牙龈癌淋巴结转移细胞系KUDO等［16］SAS舌鳞癌细胞系OKUMURA等［17］SASL1、SASH1分别为舌鳞癌低转移和高转移细胞系SQUUA、B舌鳞癌细胞系MASAAYO MORIFUJI等SCCUM1、SCCUM2分别为舌鳞癌高转移、低转移细胞系NAKAYAMA等［18］OSC19舌癌颈淋巴结转移细胞系KAWASHIRI等［19］OSC20舌癌颈淋巴结转移细胞系YOKOI等［20］SCC9、15、25、66、111口腔癌SCC系列KBOECM1、686LN、1483、Tu183口腔鳞癌细胞系KOSCC11高分化下牙龈癌细胞系LEE等［21］KOSCC25有A、B、C、D、E五种，下牙龈癌细胞系KOSCC33有A、B两种，上颌窦癌细胞系AMOSⅢ口底癌细胞系（无烟草吸食者）KAUR等［22］SACC、CAC2涎腺腺样囊性癌细胞系TYS、HSG涎腺癌细胞系为38.5%，均高于原发瘤的移植成功率20.5%，大约1/3的人癌组织在裸鼠中可持续性生长建立人肿瘤瘤株,当肿瘤传到第3代后，90%的移植瘤株可成为肿瘤细胞系。

      总之，20多年来，国内、外建立的口腔癌细胞系种类较多，这些细胞系的大部分已为我国口腔癌的基础研究所应用，为研究肿瘤的生物学特征，探明口腔癌瘤侵袭和转移机制，进行各种细胞和分子水平的干预研究等提供了极为有用的实验材料。能建立长期生长、世代繁殖又具有原发肿瘤的各种生物学特征的细胞系是一件具有挑战性和创造性的工作，往往花费很长的时间，经过多次培养、多次失败后才偶获成功。建立具有自身特色的口腔癌细胞系，具有理论和实际意义。

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