小鼠树突状细胞经脂多糖诱导成熟前后超微结构的适应性变化

小鼠树突状细胞经脂多糖诱导成熟前后超微结构的适应性变化作者：骆德平,李勇,李代庆,季平,王涛,邱丽华,刘平    作者单位：重庆医科大学口腔医院 口腔颌面外科，重庆 400015     【摘要】 目的 研究树突状细胞成熟前后细胞超微结构的一系列适应性变化。方法 经粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-4（IL-4）诱导小鼠骨髓单个核细胞分化为未成熟树突状细胞，倒置相差显微镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面标志。再经脂多糖（LPS）诱导48 h成熟，经透射电镜观察诱导成熟前后树突状细胞超微结构并加以比较分析。结果 树突状细胞经LPS刺激成熟后，其细胞表面树枝状突起明显减少，细胞内器持续增多，同时细胞核直径增大。结论 树突状细胞表面突起的分布状态，可能决定了抗原呈递能力的大小，同时也是细胞功能潜力及状态的一种潜在标尺。     【关键词】  树突状细胞,脂多糖,超微结构　　Adaptive changes of ultrastructures of dentritic cells during maturation induced by lipopolysaccharide  LUO De-ping, LI Yong, LI Dai-qing, JI Ping, WANG Tao, QIU Li-hua, LIU Ping. （Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, College of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China）　　[Abstract]  Objective  To investigate the adaptive changes of ultrastructure of the dentritic cells（DC） before andafter maturation. Methods  The murine bone marrow mononuclear cells were induced into immatured dendritic cells with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（GM-CSF） and interleukin-4（IL-4）. The cell morphology was observed under an inverted phase contrast microscope, and the surface markers were detected by flow cytometry. Then the DC was induced to be matured with lipopolysaccharide（LPS） for 48 hours, the ultrastructures of DC wasobserved before and after maturation under transmission electron microscope and then a comparative analysis was doned. Results  The surface processes of matured dentritic cells stimulated by LPS decreased significantly, whereas the organelles and the diameter of nucleolus increased. Conclusion  The distribution of surface processes may be associated with the antigen-presenting capacity of DC, and it is also a potential ruler of cell function and status.　　[Key words]  dentritic cell； lipopolysaccharide； ultrastructure　　树突状细胞（dentritic cell，DC）是目前已知的体内功能最强的抗原呈递细胞，是唯一能在体内直接激活初始T细胞的抗原呈递细胞，树突状细胞在体内抗肿瘤免疫治疗等方面有重要作用[1]。研究[2-3]发现，未成熟DC摄取抗原的功能较强，在抗原和细胞因子等刺激下，DC逐渐成熟并迁移到外周免疫器官，丧失摄取抗原的能力，发挥递呈抗原的作用，激活T细胞，启动免疫应答。目前，越来越多的学者致力于树突状细胞相关的免疫治疗研究，基于树突状细胞的肿瘤疫苗得到了较好的发展[4]。本实验立足于细胞结构与功能的关系，以粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulat-ing factor，GM-CSF）和白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）诱导小鼠骨髓单个核细胞向未成熟树突状细胞分化，经脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导其成熟，通过透射电镜（transmission electron micro-scope，TEM）比较观察诱导前后细胞超微结构，经过比较分析，初步研究树突状细胞成熟过程中可能存在的一系列适应性变化。1  材料和方法　　1.1  主要设备　　Air Tech超净工作台（苏净集团安泰公司），TDZ5-WS多管架自动平衡离心机（湘仪离心机厂），Nikon ECLIPSE TE 2000-u倒置相差显微镜（日本尼康公司），YCP-200 CO2孵箱（上海易亮医疗器械有限公司），TECNAI10透射电镜（荷兰飞利浦公司），FACSCalibu流式细胞仪（Becton-Dickinson公司，美国）。　　1.2  主要试剂　　重组小鼠GM-CSF、重组小鼠IL-4（Peprotech公司，美国），胎牛血清（Hyclone公司，美国），LPS、红细胞裂解液（Sigma公司，美国），FITC标记的抗小鼠MHC-Ⅱ和CD11c抗体、PE标记的抗小鼠CD80和CD86抗体（EB公司，美国），RMPI 1640培养基、PBS液（重庆医科大学基础研究所）。　　1.3  实验对象　　C57小鼠，6～8周龄，雌性（购于重庆医科大学动物实验中心）。　　1.4  方法　　1.4.1  小鼠骨髓细胞的制备  参照Inaba等[5]方法并加以改进，取6~8周龄C57小鼠，经断颈处死后，置于75%消毒乙醇内浸泡5 min，超净工作台内无菌取小鼠股骨及胫骨，置于75%消毒乙醇内浸泡10 min，剥尽肌肉组织，剪断骨两端，以1 mL空针吸取PBS液，分别从两端插入骨髓腔，反复冲洗，直至骨变白，将冲洗液即骨髓细胞悬液经200目细胞筛过滤，以离心管收集过滤液体，以1∶3体积加入红细胞裂解液，静置5 min，离心1 500 r/min，5 min，弃上清液，加入PBS液洗脱混匀后离心（1 500 r/min，5 min，3次），收集沉淀的骨髓细胞。　　1.4.2  树突状细胞的培养  将收集到的小鼠沉淀的骨髓细胞重悬于10%胎牛血清的RMPI 1640培养液，接种于6孔培养板中，置于37 ℃，5%CO2孵箱中孵育3 h，弃悬浮细胞，重新加入10%胎牛血清的RMPI 1640培养液，同时加入重组小鼠GM-CSF、IL-4，质量浓度分别为100、50 μg/L，继续孵育，培养第3、5天半量换液，同时追加细胞因子，质量浓度同前，培养至3、5、7 d，于倒置相差显微镜下观察，经电荷耦合器件（charge coupled device，CCD）采集成像，观察悬浮细胞形态变化情况，在细胞形态学上判定树突状细胞的诱导形成，于培养第5天，离心收集部分细胞用流式细胞仪检测细胞表面CD80、CD86、CD11C、MHC-Ⅱ等表达百分率，部分细胞用透射电镜观察细胞超微结构，进一步在细胞表面标志及细胞超微结构方面判定树突状细胞的诱导形成并予以鉴定，剩余细胞样本加入LPS，质量浓度为100 μg/L，培养48 h即第7天，离心收集细胞再次用透射电镜观察，前后2次电镜观察均随机选择5个视野，计数细胞表面突起数目，计数胞内高密度颗粒数目，通过计算细胞核最大与最小直径均值的图上距离，并与图上比例尺比较，得出细胞核直径，比较分析前后2次电镜观察结果在细胞表面突起数目、胞内高密度颗粒数目及胞核直径3方面的变化。2  结果 　　2．1  倒置相差显微镜下观察细胞形态　　培养至第3天，部分细胞表面出现放射状突起改变（图1）；培养至第5天，出现类似改变的数量持续增多，细胞表面放射状突起改变更加明显（图2）；培养至第7天，有树突状突起改变的细胞数量趋于减少，可见部分细胞聚集成簇（图3）。　　2．2  流式细胞仪检测结果　　细胞培养至第5天，经离心收集部分细胞样本，用流式细胞仪检测细胞表面标志CD80、CD86、CD11C、MHC-Ⅱ表达，结果提示各检测指标均有不同程度的表达，其中MHC-Ⅱ表达最高，CD86次之，CD80表达最低，各项指标检出百分率由高到低依次为MHC-Ⅱ为91.45%，CD86为83.27%，CD11C为77.72%，CD80为57.48%。　　2.3  透射电镜观察细胞超微结构　　细胞培养第5天，将离心收集的部分样本用透射电镜观察，如图4、5所示。图4示细胞表面可见部分细胞突起样改变，但不显著，胞内及核内密度较均匀，密度不高；图5示细胞表面树突状突起明显增加，呈放射状，细胞质内高密度颗粒增多，细胞核密度增加，核仁明显；细胞培养第7天，将剩余细胞经离心收集后再用透射电镜观察，如图6所示，细胞表面突起减少且不显著，胞内高密度颗粒持续增多，但核内密度减低，呈均质状，细胞核直径增大，核仁不明显。　　2.4  成熟前后细胞超微结构相关参数比较　　通过前后2次透射电镜观察，得出DC细胞表面触突分布情况、细胞内高密度颗粒数量及胞核直径结果，见表1。配对样本均数的t检验显示，各项差异均有统计学意义（P＜0.001），可以认为成熟树突状细胞较未成熟树突状细胞表面细胞触突减少，细胞内高密度颗粒持续增多，细胞核直径增大。3  讨论 　　本实验在小鼠骨髓单个核细胞中，加入GM-CSF、IL-4共培养，再经LPS刺激成熟，培养细胞经倒置相差显微镜、透射电镜观察，部分细胞具有典型的树突状细胞形态改变，经流式细胞仪检测细胞表面标志物，这些细胞表面不同程度地表达CD80、CD86、CD11C、MHC-Ⅱ等，最终在形态学与生物学两个方面证实了树突状细胞的诱导培养成功[6]。　　树突状细胞来源于骨髓CD34+细胞，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的关键。王志勇等[7]研究发现，利用载有肿瘤抗原成分的DC，经体外途径诱导的混杂淋巴细胞，对舌癌细胞的生长产生了显著的抑制效应。未成熟DC表达较低的MHC-Ⅱ和共刺激分子，摄取和加工抗原的能力较强，但递呈抗原和活化T细胞的能力很弱。一旦成熟，DC不再摄取抗原，而表达高水平的MHC-Ⅱ和共刺激分子，可将抗原信息递呈给T细胞，启动特异性免疫应答[8]。诱导培养所获得的树突状细胞多为不成熟DC，高表达与吞噬相关的受体，低表达共刺激分子与黏附分子，在功能上具有较强摄取和加工处理抗原的能力，几乎不具备刺激初始T细胞的能力，可参与诱导免疫耐受，而成熟DC低表达与吞噬相关的受体，高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD90、CD86、CD40、CD5和热休克蛋白等免疫刺激分子，在一定条件下成熟DC能够分泌Th1细胞因子，激活初始T细胞，发挥抗肿瘤作用。因此，树突状细胞的成熟阶段显得尤为重要。　　LPS是一种含糖和脂质的化合物，在组成上糖的分量多于脂，为革兰阴性细菌外膜的一种主要成分，LPS的脂酰链嵌入于细菌的外膜，其糖链暴露于细菌的表面，并具有抗原性（通常称为O抗原）[9]，是革兰阴性细菌的主要致病物质。在体外，LPS短期刺激可使GM-CSF诱导的小鼠骨髓细胞来源的DC成熟，表达高水平的MHC-Ⅱ和共刺激分子[10]。在研究DC成熟的实验中，人们通常在DC培养的后期用LPS一次性短期刺激，以诱导DC成熟[11]，表现为：MHC-Ⅱ、共刺激分子和某些黏附分子表达增加，摄取抗原的能力降低，递呈抗原的能力增强，刺激同种异体基因T细胞增殖能力提高。本实验充分利用LPS这一特性，经过体外途径，利用LPS替代肿瘤抗原，作为树突状细胞成熟的刺激因素，使实验流程得到有效简化，具有可行性。　　本实验研究发现，由小鼠骨髓细胞诱导培养的未成熟树突状细胞，经LPS刺激成熟，比较分析透射电镜观察结果，发现细胞表面突起显著减少，细胞内高密度颗粒持续增多，吴淑燕等[12]推测该结构可能是不典型的Birbeck颗粒，其与树突状细胞摄取和处理抗原的能力密切相关；同时本实验显示细胞核直径增加，结合树突状细胞成熟前后其功能的变化，提示树突状细胞表面突起在识别和结合肿瘤抗原的过程中可能起着关键的作用：早期未成熟DC细胞表面触突数量较多，与肿瘤抗原的特异性结合位点较多，随着树突状细胞向次级淋巴器官的迁移，细胞逐渐成熟，此时虽然细胞内部高密度颗粒持续增多，细胞处于活跃的功能状态，但因其表面触突减少，导致细胞表面与肿瘤抗原结合位点的减少并逐渐丧失，无法继续完成肿瘤抗原的识别与结合，只能对前期结合的抗原进行加工处理、呈递、激活幼稚T细胞产生细胞毒性T淋巴细胞，启动机体免疫应答。因此，树突状细胞表面突起的分布状态，可能决定了抗原呈递能力的大小，同时也是细胞功能潜力及状态的一种潜在标尺。　　树突状细胞识别并结合肿瘤抗原，然后完成抗原呈递，激活初始T淋巴细胞，产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞，启动免疫应答，杀灭体内肿瘤细胞，实现机体抗瘤的过程，是一系列复杂的分子生物活动，其间细胞内超微结构，尤其是微丝、微管等细胞骨架结构是否发生了相应的变化，肿瘤抗原的加工呈递如何与这些超微结构发生关系等，都需要后续的深入研究，本实验可为这些进一步的实验研究提供一些启示。【参考文献】  [1] 王志勇, 李声伟, 胡勤刚, 等. 口腔鳞癌中树突状细胞的免疫组化分析[J]. 华西口腔医学杂志, 2004, 22（2）：103-105. 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