辛伐他汀对人牙周膜细胞成骨活性的影响
发表时间：2009-10-14 浏览次数：667次
辛伐他汀对人牙周膜细胞成骨活性的影响作者：胡飞,张雪洋,王春先,周磊 作者单位：广东省口腔医院·南方医科大学附属口腔医院 正畸科，广东 广州 510280 【摘要】 目的 研究辛伐他汀对人牙周膜细胞成骨活性的影响。方法 将第3代人牙周膜细胞在条件矿化培养液中诱导培养，同时加入不同浓度的辛伐他汀，将其分为A组（0 mol/L）、B组（1×10-9 mol/L）、C组（1×10-8 mol/L）、D组（1×10-7 mol/L）、E组（1×10-6 mol/L），分别检测碱性磷酸酶活性、骨桥蛋白（OPN）表达，并对矿化结节进行计数。结果 辛伐他汀各浓度组（1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6 mol/L）均能促进人牙周膜细胞的成骨分化和矿化，其中1×10-8、1×10-7、1×10-6 mol/L与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），1×10-7 mol/L的辛伐他汀组促进成骨活性的作用最明显。结论 适宜浓度的辛伐他汀可以有效促进人牙周膜细胞的成骨活性。 【关键词】 辛伐他汀,牙周膜细胞,成骨活性 Effects of Simvastatin on osteoblast activity of human periodontal ligament cells HU Fei, ZHANG Xue-yang,WANG Chun-xian, ZHOU Lei. （Dept. of Orthodontics, Guangdong Provincial Stomatological Hospital, Guangzhou510280, China） [Abstract] Objective To study the effects of Simvastatin on the osteoblast activity of human periodontal liga-ment（PDL） cells. Methods The third passage human PDL were cultured in conditional mineralization medium withdifferent concentrations of Simvastatin. The cells were divided into A group（0 mol/L）, B group（1×10-9 mol/L）, C group（1×10-8 mol/L）, D group（1×10-7 mol/L） and E group（1×10-6 mol/L）. Alkaline phosphatase（ALP） activity, osteopontin（OPN） and capability of mineralization were measured. Results Differentiation osteoblast and mineralization of human PDL were improved in all treatment groups with different concentrations of Simvastatin（1×10-9, 1×10-8, 1×10-7,1×10-6 mol/L）. Compared with control group, statistically significant differences were found in 1×10-8 mol/L, 1×10-7 mol/Land 1×10-6 mol/L groups（P<0.05）. The maximum effect was observed at the concentration of 1×10-7 mol/L. ConclusionOptimal concentration of Simvastatin can improve the osteoblastic activity of human PDL. [Key words] Simvastatin； periodontal ligament cells； osteoblast activity 辛伐他汀是3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）抑制剂，原来是临床降低胆固醇、降低血脂、减少心脏病发生的常用药物。1999年Mundy等[1]报告关于他汀类药物在骨代谢方面的作用。随后，大量文献报道了辛伐他汀可能刺激成骨细胞骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）、血管上皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor，VEGF）、碱性磷酸酶（alkaline phos-phatase，ALP）、Ⅰ型胶原的生成，从而明显促进成骨细胞的分化[2-3]。 牙周膜细胞具有较强的合成胶原的能力，也有着成骨样分化的特点，可以形成新的主纤维、牙骨质和改建牙槽骨，是牙周再生的主要细胞来源，能促进牙周膜细胞骨形成效应的因子形成，在牙周组织工程领域将有很好的运用前景。辛伐他汀的促进骨形成效应是否同样可以作用于牙周膜细胞，这方面的研究还不多。本实验将以碱性磷酸酶活性、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）表达量改变、矿化结节计数为指标，观察辛伐他汀对体外培养的牙周膜细胞成骨活性的影响。1 材料和方法 1.1 主要材料 辛伐他汀（Simvastatin，Calbiochem公司，德国），DMEM培养基、青链霉素、Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），胎牛血清（天津华美生物工程公司），碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所），抗坏血酸（分析纯）、β-甘油磷酸钠、地塞米松（Sigma公司，美国），OPN ELISA试剂盒（Cal-biochem公司，德国）。 1.2 人牙周膜细胞的取材和培养 收集因正畸需要拔除的上下颌前磨牙，无菌条件下，用无血清DMEM冲洗牙根部数遍，用手术刀片仔细刮除附着龈（牙颈部上皮组织和牙周膜纤维），反复冲洗，去除牙根表面游离组织。用刀片刮下根中1/3的牙周膜组织，不剪切，直接移入离心管内，加入0.1%Ⅰ型胶原酶4 mL，置37 ℃摇床酶消化约20~30 min，用吸管吹打组织块使其充分松散，500 r/min离心3 min，去除上清，使用含血清DMEM漂洗2次（含100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素，10％胎牛血清，pH=7.2），终止消化，去上清。收集组织块接种于25 cm2培养瓶，加入2 mL DMEM，翻转培养瓶放置于培养箱。3 h后，待组织块贴壁，将培养瓶缓慢翻转，静置培养（饱和湿度，5%CO2，95%空气，37 ℃标准环境）。此后，每3 d换液1次，细胞铺满培养瓶底后用0.25%胰蛋白酶及EDTA消化传代。 1.3 人牙周膜细胞的鉴定 细胞形态学鉴定：倒置相差显微镜观察细胞的生长情况和形态特征。矿化结节鉴定：将第3代人牙周膜细胞按每毫升5×104个种于24孔培养板上，第2天吸出培养液，加入矿化诱导液（含10％胎牛血清、2 nmol/L β-甘油磷酸钠、10 nmol/L地塞米松、50 μg/mL维生素C）连续培养，每3 d更换1次矿化液，倒置相差显微镜观察，出现肉眼可见结节后进行茜素红染色。培养皿用PBS冲洗2次，95％乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗3次。0.1%茜素红-Tris-HCl（pH=8.3）37 ℃，30 min。蒸馏水冲洗，干燥，照相。 1.4 实验分组 对照组（A组）用DMEM矿化诱导培养基（含2％胎牛血清、2 nmol/L β-甘油磷酸钠、10 nmol/L地塞米松、50 μg/mL维生素C）培养72 h，实验组分别用的终浓度为1×10-9 mol/L（B组）、1×10-8 mol/L（C组）、1×10-7 mol/L（D组）、1×10-6 mol/L（E组）辛伐他汀在DMEM矿化诱导培养基中培养72 h。每组各有8个孔，在96孔板上培养。所用细胞均为第3代人牙周膜细胞。 1.5 辛伐他汀对细胞ALP活性的影响 诱导培养结束后加0.1%TritonX-100每孔100 μL裂解细胞2 h，吹打1 min，取50 μL细胞裂解液转移至96孔板。按碱性磷酸酶检测试剂盒步骤加入同比例缓冲液和基质液，37 ℃孵箱孵育30 min，加显色剂，在酶联免疫检测仪上测定每孔的光密度值，测量波长405 nm。 1.6 辛伐他汀对细胞OPN表达的影响 诱导培养结束后，按OPN ELISA试剂盒步骤分别进行孵育、洗板、染色后，在酶联免疫检测仪上测定每孔的光密度值，测量波长450 nm，然后根据标准底物的质量浓度计算相应的OPN质量浓度。 1.7 辛伐他汀对细胞矿化能力的影响 细胞以每毫升1×105个密度接种于24孔培养板上，24 h后将其换入含敏感浓度（0、1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6 mol/L）辛伐他汀的矿化条件培养液。3 d换液1次，于第14天矿化结节形成时，用茜素红染色法进行矿化结节染色计数。以鲜红色结节、边界清晰、直径大于200 μm为标准，作矿化结节计数。 1.8 统计学方法 使用SPSS 10.0软件包对实验组与对照组进行t检验和方差分析。2 结果 2.1 细胞的形态学观察 倒置相差显微镜下观察到，8~10 d内细胞从组织块中游出（图1），继续培养，细胞以组织块为中心呈放射状、漩涡状排列生长，细胞呈星形或长梭形，胞体丰满，胞浆均匀，核圆形或卵圆形，核仁清晰，生长致密（图2）。 2.2 矿化结节鉴定 矿化诱导液内培养人牙周膜细胞13～14 d后，可见局部细胞结节形成，结节边缘细胞坏死，分泌基质堆积。继续培养至15～16 d，细胞结节中心可见白色的矿化结节，显微镜下中心为黑色的颗粒堆积物。用茜素红染色可见结节呈红色（图3）。 2.3 辛伐他汀对细胞ALP活性的影响 在矿化诱导的条件下，辛伐他汀对人牙周膜细胞ALP活性有促进作用，1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6 mol/L浓度组与对照组比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其中1×10-7 mol/L对酶活性的影响最显著（表1）。 2.4 辛伐他汀对细胞OPN表达的影响 在矿化诱导的条件下，辛伐他汀对人牙周膜细胞OPN的表达活性有促进作用，1×10-8、1×10-7、1×10-6 mol/L浓度组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中1×10-7 mol/L组对OPN表达活性的影响最显著（表2）。 2.5 辛伐他汀对细胞矿化能力的影响 在矿化诱导的条件下，辛伐他汀对人牙周膜细胞矿化能力有促进作用，其中1×10-8、1×10-7、1×10-6 mol/L浓度组与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中1×10-7 mol/L组对细胞矿化能力的影响最显著（表3）。3 讨论 多项对长期服用他汀类药物的老年人群回顾性研究[4]结果已表明，他汀类药物可明显提高老年人或绝经期后妇女的骨密度，降低骨折发生的危险性。Chan等[5]的统计分析表明，服用他汀类药物与股骨颈骨密度增加有关，服用他汀类药物2年以上的老年妇女发生非病理性骨折的危险性下降。Maeda等[6]研究辛伐他汀对非转化成骨样细胞MC3T3-E1和鼠骨髓细胞的影响，发现辛伐他汀提高成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性和矿化结节形成，并且发现此效应呈时间、剂量依赖性。辛伐他汀在相对较低的浓度下即可诱导成骨细胞分化、明显促进矿化结节形成。大量实验研究的结果都显示他汀类药物具有促进骨形成的作用。牙周膜中含有具有分化潜能的细胞成分，它们在牙周组织再生过程中起重要作用[7]。体外实验表明，牙周膜细胞具有成骨样细胞的特点，有着高水平的碱性磷酸酶活性，在β－甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C的条件培养液中，也同样可形成矿化结节。本实验的结果显示，辛伐他汀的促骨形成作用也同样表现于人牙周膜细胞。ALP活性是反映成骨细胞成熟状态的一个重要标志。ALP使局部钙、磷浓度升高，并在胶原原纤维内沉积，有助于矿物质矿化机制的正常进行，是促进骨间质矿化的重要酶。本实验结果显示辛伐他汀促进人牙周膜细胞内ALP合成，表明辛伐他汀通过调节人牙周膜细胞的ALP合成，增强其成骨活性。OPN属于非胶原基质蛋白（noncollagenous matrix proteins，NCPs），骨和牙槽骨等硬组织依靠NCPs和胶原性支架将钙和磷酸根离子网络起来，形成矿化结构。OPN不仅在牙骨质正常形成过程中起重要作用[8]，而且也与牙骨质再生过程密切相关。有研究[9]表明：牙骨质的再生起始于OPN在牙根表面的聚集。另外，OPN在矿化组织形成过程和改建过程中主要起调节作用，它可以调节羟磷灰石的沉积，并在有些情况下也可以作为羟磷灰石结晶的核心。因此，辛伐他汀促进人牙周膜细胞表达OPN，表明辛伐他汀可以促进人牙周膜细胞向成骨方向分化，从而在牙周硬组织再生过程中发挥作用。而OPN作为矿化组织的重要细胞外基质，它们的表达量增加也有利于发挥它们在生物矿化过程中的独特作用。 本实验观察了辛伐他汀作用于人牙周膜细胞后矿化能力的改变。结果发现实验各组人牙周膜细胞较对照组更早出现细胞聚集，并出现矿化结节。这可能由于其提高了人牙周膜细胞ALP活性和OPN的表达，使细胞表现出较强的形成矿化组织的能力。【参考文献】 [1] Mundy G, Garrett R, Harris S. 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