人转化生长因子-β1基因转染对人牙龈成纤维细胞成骨特性的影响

人转化生长因子-β1基因转染对人牙龈成纤维细胞成骨特性的影响作者：储庆 吴织芬 王勤涛 何海丽 万玲 刘玲侠    作者单位：第四军医大学口腔医院 牙周病黏膜病科，陕西 西安 710032 　　【摘要】 目的 观察并评价基因转染后牙龈成纤维细胞（GF）表达外源目的基因人转化生长因子-β1（hTGF-β1）对其分化、成骨特性的影响。方法 采用碱性磷酸酶（ALP）活性检测方法检测转染对GF ALP活性的影响，免疫组化染色及图像分析评价基因转染后骨钙素（OC）、骨桥素（OPN）、骨涎蛋白（BSP）、骨结合素（ON）含量的变化，体外矿化结节形成实验检测转染后细胞成骨特性的变化。结果 转染后GF的ALP活性较未转染组有显著的提高（P<0.05），并且与牙周膜成纤维细胞（PDLCs）的ALP活性接近（P>0.05）。OC含量检测显示转染后GF的OC含量与未转染组和PDLCs组相比，其差异均无统计学意义（P>0.05）。免疫组化染色后，转染组GF所表达的OPN、ON、BSP含量均高于未转染组GF（P<0.05），而与PDLCs间差异无统计学意义（P>0.05）。第21天和第24天时，在矿化液作用下PDLCs及转染GF在倒置显微镜下可见致密的结节形成，von Kossa染色可见紫色的矿化结节形成。未转染GF未见结节形成。而转染GF在未经矿化液诱导情况下，虽出现显著的细胞聚集，但von Kossa染色未见紫色矿化结节形成。结论 转染pcDNA3-hTGF-β1后的GF可表达一定的成骨细胞特性，但这种成骨特性有限。 　　【关键词】  人转化生长因子-β1 基因转染 牙龈成纤维细胞 成骨　　Influence of transfection with human transforming growth factor-β1 gene on the osteogenic potential of the cultured human gingival fibroblast  CHU Qing，WU Zhi-fen，WANG Qin-tao，HE Hai-li，WAN Ling，LIU Ling-xia. （Dept. of Periodontology and Oral Medicine，School of Stomatology, The Fourth Military Medical University，Xi′an 710032, China）　　[Abstract]  Objective  To study the influence of transfection with human transforming growth factor-β1（hTGF-β1） gene on the osteogenic potential and differentiation of the cultured human gingival fibroblast（GF）. Methods  Enzyme kinetics method was used to measure the effects of the transfection on the alkaline phosphatase（ALP） activity. Im-munohistochemistry stain and image analysis were applied to evaluate the alteration of the content of osteopontin（OPN）, bone sialoprotein（BSP）, osteonectin（ON）, osteocalcin（OC） in the GF with transfection. Mineralization nodules formation in vitro was also used. Results  The ALP activity of the GF after transfection was higher than the GF without transfection significantly（P<0.05）, and was close to that of the PDLCs（P>0.05）. The content of OC in GFwas not improved after transfection, was similar with that of PDLCs（P>0.05）. Under immunohistochemistry stain, thecontents of OPN, ON, BSP expressed in GF with transfection were higher than those of GF without transfection（P<0.05）, but similar to those of PDLCs（P>0.05）. In the mineralized cultured medium, the nodules were observed in the GF with transfection and PDLCs after 21 days and 24 days alternatively. After von Kossa stain, purple mineralization nodules were observed. Conclusion  The GF transfected with pcDNA3-hTGF-β1 could express some osteogenic characters, though these characters are restricted. 　　[Key words]  human transforming growth factor-β1； gene transfection； gingival fibroblast； osteogenesis　　人转化生长因子-β1-pcDNA3质粒真核表达载体（pcDNA3-human transforming growth factor-β1，pcDNA3-hTGF-β1）能够转染牙龈成纤维细胞（gingi-val fibroblast，GF），并在其内获得稳定表达[1]。外源性人转化生长因子-β1（human transforming growthfactor-β1，hTGF-β1）对GF的作用比较肯定，但基因转染后GF表达外源目的基因hTGF-β1后对其生物学性状，尤其是对细胞分化、成骨特性的影响尚不清楚。本研究观察pcDNA3-hTGF-β1转染对GF生物学性状的影响，为进一步观察转染pcDNA3-hTGF-β1并能够稳定表达hTGF-β1的GF植入体内后诱导牙周组织再生的能力奠定基础。1  材料和方法　1.1  主要试剂和仪器　　hTGF-β1表达载体pcDNA3-hTGF-β1由第四军医大学口腔医院口腔内科学实验室构建，G-418、DMEM培养基（Gibco公司，美国），胎牛血清（杭州四季青公司），噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、β-甘油磷酸钠、β-维生素C、地塞米松（Sigma公司，美国），兔抗人TGF-β1抗体、SABC免疫组化试剂盒、兔抗人骨桥素抗体、兔抗人骨涎蛋白抗体、兔抗人骨结合素抗体（武汉博士德公司），碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）试剂盒（北京中生生物工程高技术公司）。　1.2  pcDNA3-hTGF-β1转染对细胞ALP活性的影响　　分别收获已转染pcDNA3-hTGF-β1并经G418筛选4周的GF和未转染pcDNA3-hTGF-β1的GF以及同一个体的牙周膜成纤维细胞（periodontal ligamentcells，PDLCs），制备单细胞悬液，计数，调整细胞密度为每毫升5×104个，将PDLCs、未转染组和转染组GF分别接种于96孔板，接种每种细胞各6孔，每孔200 μL，置5%CO2培养箱内培养。于贴壁后2 d进行ALP检测。具体操作步骤为：取新配制的工作液100 μL，加入待测检品50 μL，37 ℃孵育30 min，每孔加入0.2 mol/L NaOH 50 μL终止反应，于波长410 nm的酶联免疫仪上行光密度值测定，取平均值进行统计学处理。　1.3  骨相关蛋白含量的检测 　　1.3.1  骨钙素（osteocalcin，OC）含量的检测  取转染后第5代GF和未转染GF以及同一个体的PDLCs，以细胞密度为每毫升5×104个接种于96孔板中，每孔200 μL，在含有100 mL/L FBS的DMEM、标准环境下培养5 d。取待测各组细胞上清液100 μL、125I标记的OC抗体100 μL和未标记的OC抗体100 μL混合后，4 ℃放置24 h。每管加入分离剂0.5 mL，混匀后室温放置20 min，4 ℃下3 500 r/min离心20 min，弃上清，检测沉淀物的放射剂量。由自动γ计数仪预先编好的程序，直接输入相关数据、标准曲线及样品质量浓度，最后以ng/mL表示。取均值进行统计学分析。　　1.3.2  骨桥素（osteopontin，OPN）含量的检测  细胞标本经3 mL/L的过氧化氢甲醇溶液及3 mL/L triton-X100处理，正常山羊血清封闭20 min，加一抗（兔源性骨桥素抗体，滴度为1∶150）室温2 h，0.01 mol/L PBS（pH7.4）冲洗，加二抗20 min，PBS冲洗，加SABC 20 min，DAB显色。设阴性对照，即以正常兔血清替代一抗。　　1.3.3  骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）含量的检测  细胞标本经3 mL/L的过氧化氢甲醇溶液及3 mL/L triton-X100处理，正常山羊血清封闭20 min，加一抗（兔源性骨涎蛋白抗体，滴度为1∶150）室温2 h，0.01 mol/L PBS（pH7.4）冲洗，加二抗20 min，PBS冲洗，加SABC 20 min，DAB显色。设阴性对照，即以正常兔血清替代一抗。　　1.3.4  骨结合素（osteonectin，ON）含量的检测  细胞标本经3 mL/L的过氧化氢甲醇溶液及3 mL/L triton-X100处理，正常山羊血清封闭20 min，加一抗（兔源性骨结合素抗体，滴度为1∶150）室温2 h，0.01 mol/L PBS（pH7.4）冲洗，加二抗20 min，PBS冲洗，加SABC 20 min，DAB显色。设阴性对照，即以正常兔血清替代一抗。　　1.3.5  免疫组化结果判断  免疫组化染色阳性细胞间质呈棕褐色。应用LeicaQ 550IW计算机图像分析系统及其软件定量评价呈阳性免疫组化染色的细胞间质的灰度值（灰度分级0～255级，0级为最深，255级为最浅），每组分别取3张细胞爬片，每张随机采集3个高倍视野进行测定（×200，向同一个方向移动细胞爬片，不重叠，不重复），测得结果取平均值，作为每张细胞爬片视野内棕褐色的平均灰度值，再取每组3张的灰度平均值，作为各组细胞OPN、BSP、ON表达的间接数值。　1.4  矿化结节形成实验　　取转染后第3代GF、未转染GF和PDLCs以细胞密度为每毫升5×104个接种于24孔板中，在含有10%胎牛血清的DMEM培养液标准环境下培养24 h后，换入含矿化液（10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/Lβ-维生素C和10-8 mol/L地塞米松）和10%胎牛血清的DMEM培养液，每3 d换液1次，连续培养27 d。取出盖玻片，以4 g/L中性甲醛固定，采用von Kossa染色法进行染色，光镜下观察矿化结节形成情况。　1.5  统计学分析　　采用SPSS 10.0统计软件对数据进行分析。实验数据均来自独立的3次实验。多组数据比较用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。2  结果　2.1  pcDNA3-hTGF-β1转染对细胞ALP活性的影响转染组、未转染组、PDLCs组ALP活性的检测结果分别为0.397±0.036、0.106±0.035、0.453±0.102。转染后GF的ALP活性较未转染组有显著提高（P<0.05），并且与PDLCs的ALP活性接近（P>0.05）。　2.2  骨相关蛋白含量的检测结果　　2.2.1  骨钙素含量的检测结果  转染组、未转染组、PDLCs组骨钙素含量检测结果分别为（1.173±0.026）、（1.046±0.045）、（1.231±0.017） ng/mL。转染后GF的骨钙素含量较未转染组有提高，但差异没有统计学意义（P>0.05），与PDLCs比较差异也无统计学意义（P>0.05）。　　2.2.2  骨桥素、骨涎蛋白、骨结合素的免疫组化染色结果  免疫组化染色后，OPN在转染组和未转染组GF及PDLCs中均有表达，未转染组表达呈弱阳性，而转染组GF及PDLCs胞浆表达均呈阳性或中度阳性（图1），二者表达量均高于未转染组。BSP仅见于PDLCs和转染组GF，而未转染组GF未见表达（图2）。ON在转染组和未转染组GF及PDLCs中均有表达，转染组为阳性表达，未转染组表达呈弱阳性（图3）。未见OPN和BSP表达于细胞膜和细胞核　　经图像分析软件测得每张细胞爬片视野内棕黄色的平均灰度值，再取每组3张切片的灰度平均值，作为每组细胞OPN、BSP、ON表达的间接数值，其结果见表1。由表1可见，转染组GF的OPN、BSP和ON表达均高于未转染组，且差异有统计学意义（P＜0.05），而与PDLCs间差异无统计学意义（P>0.05）。　2.3  矿化结节形成实验　　在矿化液的作用下，随时间的延长，转染组GF的细胞密度逐渐增大，呈复层生长，并在局部聚集。在第21天和第24天时，PDLCs和转染组GF在倒置显微镜下可见致密的结节形成，von Kossa染色可见紫色的矿化结节（图4）。而未转染组细胞虽经矿化液诱导仍未见结节形成。转染组GF在未经矿化液诱导的情况下，至第27天虽已出现显著的细胞聚集，但经von Kossa染色未见紫色的矿化结节形成。3  讨论　　转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一种具有多种功能的生长因子，可以促进Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型胶原、OPN、ON、糖蛋白的合成[2]，可以促进牙周膜细胞的增殖及DNA合成[3]，还可提高细胞的ALP活性及总蛋白含量，能促进人牙周膜细胞的分化[4]。GF在组织发生及某些生理特性上与PDLCs类似，基本上TGF-β1对GF的作用与PDLCs也类似，不过GF对TGF-β1的反应弱于PDLCs[5]。BSP是一种高度糖基化和硫酸化的磷蛋白，是骨基质的主要非胶原蛋白之一，是矿化组织特异性蛋白[6]。在成熟的骨形成细胞中表达，是成骨细胞分化的晚期标志。主要功能是作为羟磷灰石形成的初始核心启动矿化过程，其基因序列中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-asparticacid，RGD）的细胞黏附序列。BSP通过RGD序列结合于细胞表面，介导细胞与细胞、细胞与基质相互作用，刺激羟磷灰石开始形成及生长。　　OPN是分泌型糖基化的磷蛋白，不是矿化组织特有[7]。在成骨细胞分化早期开始表达，矿化启动后大量合成。它的作用是调节羟磷灰石晶体。OPN也含有RGD序列，能结合于细胞和骨组织的羟磷灰石表面起桥梁作用。正常情况下它不能作为矿化结晶形成的初始核心，而是在矿化启动后调控矿化晶体的大小和形状。在缺乏BSP和胶原时OPN可作为矿化结晶的成核子起BSP的作用，启动矿化过程。ON是骨基质蛋白，富含半胱氨酸，是骨基质中含量较多的非胶原性基质蛋白，在启动矿化过程中和促使矿物质在胶原成分上沉积有重要的作用，能将游离的Ca2+沉积到Ⅰ型胶原上，启动骨基质的矿化过程，并将矿化结晶吸附于胶原纤维上。以往的研究认为，ON是成骨细胞表型之一，处于活动期的成骨细胞及骨祖细胞能合成ON。以往的研究证实：TGF-β1可以提高成骨细胞ON的表达[2]。　　实验中发现未转染GF不表达BSP，其OPN的表达也低于PDLCs及转染GF，说明GF的成骨特性较低。而通过转染TGF-β1可提高细胞BSP、OPN和ON表达，与PDLCs接近。并且在矿化液诱导下，转染GF可形成矿化结节，在一定程度上提高了细胞的成骨特性。转染后GF中表达BSP，它是骨基质的主要非胶原蛋白之一，是矿化组织特异性蛋白。在成熟的骨形成细胞中表达，它的主要功能是作为羟磷灰石形成的初始核心，是成骨细胞分化的晚期标志，提示转染后细胞具有成骨细胞特性。　　本实验中发现转染GF的成骨特性有限，首先，转染GF的OC含量较未转染组没有显著提高；其次，在矿化结节形成实验过程中，在未加入矿化液的条件下，PDLCs及转染GF在观察时间内未出现矿化结节，只有在矿化液存在的前提下才出现矿化结节。虽然转染后GF的OPN显著增加，但OPN不是矿化组织特有，只是成骨细胞分化的早期标志，不能作为矿化结晶形成的初始核心，所以在未加矿化液的情况下，矿化结节不能形成。也发现转染后GF虽然有BSP表达，其主要功能是作为羟磷灰石形成的初始核心，启动矿化过程，但实验中细胞在体外未加矿化液的条件下并没有形成矿化结节，说明体外矿化结节的形成是一个复杂过程，在这一过程中有多种因素参与，同时也提示转染后GF的成骨特性有限。【参考文献】　　[1] 储庆, 吴织芬, 何海丽, 等. 人转化生长因子β1基因转染人牙龈 成纤维细胞及其稳定表达[J]. 口腔医学研究, 2004, 20（2）：136- 138. CHU Qing, WU Zhi-fen, HE Hai-li, et al. Transfection of cul- tured human gingival fibroblasts with human transforming growth factor-β1 gene and stable expression in vitro[J]. J Oral Sci Res, 2004, 20（2）：136-138.　　[2] Noda M, Rodan GA. Type beta transforming growth factor（TGF beta） regulation of alkaline phosphatase expression and other phenotype-related mRNAs in osteoblastic rat osteosarcoma cells [J]. J Cell Physiol, 1987, 133（3）：426-437.　　[3] 吴织芬, 董广英, 万玲. 转化生长因子-β和胰岛素对人牙周膜 细胞增殖的影响[J]. 中华口腔医学杂志, 1997, 32（5）：300-302. WU Zhi-fen, DONG Guang-ying, WAN Ling. The effects of transforming growth factor β and insulin on proliferation of hu- man periodontal ligament cells[J]. Chin J Stomatol, 1997, 32（5）： 300-302. 　　[4] 董广英, 吴织芬, 王勤涛, 等. 胰岛素和转化生长因子-β对人牙 周膜细胞碱性磷酸酶活性和总蛋白含量的影响[J]. 华西口腔医 学杂志, 2001, 19（3）：146-148. DONG Guang-ying, WU Zhi-fen, WANG Qin-tao, et al. Effects of insulin and transforming growth factor-β on alkaline phos- phatase activity and total protein content in human periodontal ligament cells[J]. West China J Stomatol, 2001, 19（3）：146-148.　　[5] Dennison DK, Vallone DR, Pinero GJ, et al. Differential effect of TGF-beta 1 and PDGF on proliferation of periodontal liga- ment cells and gingival fibroblasts[J]. J Periodontol, 1994, 65 （7）：641-648.　　[6] Ganss B, Kim RH, Sodek J. Bone sialoprotein[J]. Crit Rev Oral Biol Med, 1999, 10（1）：79-98.　　[7] Chien HH, Lin WL, Cho MI. Expression of TGF-beta isoforms and their receptors during mineralized nodule formation by rat periodontal ligament cells in vitro[J]. J Periodontal Res, 1999, 34（6）：301-309.