口腔与胃内幽门螺杆菌关系的研究

口腔与胃内幽门螺杆菌关系的研究作者：靳松    作者单位：泰山医学院附属泰安医院口腔科，山东 泰安 271000    【摘要】  目的 研究胃病患者口腔中是否存在幽门螺杆菌（Hp），并分析胃病患者牙周状况与幽门螺杆菌的关系。方法 依据特异的尿素酶C 基因和 cag A基因设计引物，建立聚合酶链反应（PCR）方法,检测65例慢性胃病患者不同牙齿的龈上和龈下菌斑中的Hp。6例胃Hp阳性的胃炎患者，经药物治疗后，检测口腔Hp。 结果 65例慢性胃病患者胃黏膜标本中，PCR检测阳性的标本58例（89.3%），龈下菌斑Hp阳性率（47.7%），高于龈上菌斑中的Hp阳性率（26.2%）。牙周袋深度（PD）≥4 mm部位菌斑中Hp检出率显著高于PD<4 mm的部位（P<0.05）。6例胃炎患者，经药物治疗后口腔仍检出Hp。结论 口腔Hp是慢性胃病患者Hp感染的重要来源。    【关键词】  幽门螺杆菌 菌斑 胃炎 聚合酶链反应    Study of Helicobacter pylori in oral cavity and stomach in chronic gastritis patients JIN Song, GAO Jing ( Dept. of Stomatology,  Taian City Central Hospital, Taian 271000,China)    Abstract:Objective: To investigate the prevalence of Helicobacter pylori(Hp) in the oral cavity of gastritis patients, and analyze the relationship between chronic periodontal disease and Hp in the patients.  Methods:  A polymerase chain reaction (PCR) assay with oligonucleotide primers homologous to a portion of the urease C and  cytotoxin associated gene A (cag A) of Hp was used to test the presense of Hp in dental plaque. Sixty-five gastric disease patients were recruited to detect Hp in supraand subgingival  plaque. Results:   Sixty-five chronic gastritis patients, 58 patients (89.3%) had at least one Hp positive dental plaque sample. The Hp positive rate was significantly higher in the supragingival plaque (47.7%) than that in the subgingival plaque (26.2%). The prevalence of Hp was positively correlated with probing depth. Conclusion: Oral Hp infection may be an important source of gastric Hp infection.    Key words:Helicobacter pylori; dental plaque; gastritis;  PCR    幽门螺杆菌（Helicobacter polori, Hp）是一种营养要求高、微需氧的革兰氏阴性菌。自从1983年Warren和Marshall发现Hp以来，大量研究表明Hp是慢性活动性胃炎和十二指肠溃疡的主要致病因素，与胃溃疡密切相关,与胃癌的发生有关［13］。近年来有关Hp的研究很多，但Hp的传播途径尚无定论［4,5］，多数观点认为是口—口传播。口腔是消化道的入口，也是人体的一个重要微生态环境。但口腔作为Hp聚集地的假说仍然处于争论中［6］。本研究重点分析慢性胃病患者口腔中是否存在Hp，胃病患者牙周状况与Hp的关系，了解胃病治疗前后口腔与胃内Hp的变化情况。1  材料和方法    1.1  病例选择    从泰山医学院附属泰安医院消化科选择65例有上消化道症状并经全口牙周检查有牙龈炎、不同程度牙周炎的患者进行胃镜检查。男38例，女27例，年龄20—62岁。否认有其它系统性疾病；3个月内未服用过抗生素及胃药；12个月内未接受过牙周治疗，全口牙不少于24颗。对其中的6例患者药物治疗后追踪复查，从治疗前同样的牙齿部位重复取样进行检测。    1.2  取样和检查    从每例患者口腔内选择有牙龈炎症的6颗牙作为取样牙。以棉球隔湿，吹干后分别用消毒刮匙刮取龈上、龈下菌斑，即刻检查并记录牙周临床指数：菌斑指数（PLI），牙周袋深度（PD），出血指数。将取样标本置于含100 μl样本处理液的Eppendorf管内。随后常规胃镜检查，胃黏膜取3块活检组织，分别作尿素酶试验（RUT），组织病理和PCR检测Hp。    1.3  DNA提取    PCR试剂由上海宝生物工程有限公司提供，将标本悬浮于100 μl样本处理液中，56 ℃孵育30 min，高速震荡10 s后置100 ℃水浴8分钟，再次高速震荡10 s，离心（12000 r/min，4 ℃）3 min，取上清用于PCR扩增。    1.4   PCR检测Hp    参考Bickley,Lage等的研究，引物根据尿素酶C基因和CagA基因进行设计，预期扩增片段为294 bp及400 bp。20 μl反应体系内两对引物20 pmol/L，每种寡核数4 mmol/人，DNA模板4 μl，TagDNA聚合酶2 u及PCR缓冲液，反应在PCR扩增仪（美国PE公司）上进行，94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min为一个循环，共计35循环，循环结束后72 ℃继续延伸7 min，以Hp标准株NCTC11637（中国预防科学院提供）的DNA提取液作阳性对照，采用PCR试剂盒内的阴性对照，用8%丙烯酰胺电泳鉴定PCR产物。    1. 5  统计学处理  应用SPSS12.0统计分析软件处理数据。 计数资料的组间比较采用卡方检验。2  结 果    2.1  胃黏膜中的Hp    65例慢性胃病患者胃黏膜标本中，PCR检测阳性的标本58例（89.3%），其中18例为CagA阳性，尿素酶实验和PCR检测均为阳性的标本52例（86.1%）。    2.2  牙菌斑中的Hp  菌斑中Hp阳性结果见表1。表1  龈上和龈下菌斑中的Hp分布注：与龈上菌斑组比较，*P＜0.05。    2.3  Hp检出与牙周状况的关系    慢性胃病Hp的检出率与牙周临床指数的关系见表2,牙周袋深度（PD）≥4 mm部位菌斑中Hp检出率高著于PD<4 mm的部位（P<0.05）。表2  不同牙周情况下菌斑Hp检出率的比较注：与PD<4指标比较，*P＜0.05。    2.4  胃炎治疗前后胃内及口腔Hp的变化    6例胃炎患者进行药物治疗后的复查，他们在治疗前胃尿素酶实验及PCR检测均为阳性，口腔内也至少一个部位Hp阳性。治疗复查时，尿素酶实验有2例阳性，PCR检测均为阳性。表3显示72份菌斑Hp检出率较治疗前降低（P<0.05）表3  治疗前后牙菌斑中Hp的检出结果注：与治疗前比较，*P＜0.05。3  讨  论    长期以来，人们认为胃是Hp唯一的生存环境，但近年的研究证明，人口腔、唾液中也可培养出Hp。自1989年Kjaden等首次从胃炎患者牙菌斑中分离出Hp，其后许多学者采用不同方法在唾液，返流呕吐物中检测到Hp的特异基因，因此推测口腔是Hp在人体的另一个重要聚集地。为了证实这一推测，人们采用多种方法研究口腔中的Hp。细菌培养是分离细菌的标准方法，但口腔中的微生物种类多达300多种，而Hp数量少，营养要求复杂，因此牙菌斑内Hp的培养结果很不稳定。PCR是检测细菌病原体的有利工具，其敏感性高特异性强，已被广泛用于Hp的检测。本研究采用的尿素酶C基因和CagA基因其特异性和敏感性较高。胡文杰等［7］报告胃病患者口腔多部位存在Hp，尤以龈下菌斑的Hp检出率高。我们的研究也支持这一观点,即口腔是Hp的另一个生存环境。    我们的研究也证实胃病患者口腔中不仅存在幽门螺杆菌，而且尤以龈下菌斑区多见，这可能由于Hp 是一种微需氧的革兰氏阴性或专性厌氧菌,牙周袋内氧化—还原电势低，龈沟液内蛋白酶增加等均有利于革兰氏阴性或专性厌氧菌生长，致龈下菌斑数量急剧增加，菌斑的生态学和菌斑的发酵产酸适宜的温度均有利于Hp的生长。实验证实，Hp不仅能在人类菌斑唾液中检出，而且抗Hp治疗后不能从胃黏膜检出，但仍存在于口腔内，这表明上消化道病与口腔中的Hp有一定的关系。本研究还分析慢性胃病患者Hp的存在与牙周袋深度及炎症状况的关系。结果提示PD≥4 mm的部位，菌斑中Hp检出率显著高于PD<4 mm的部位。这些结果皆表明炎症和中等深度的牙周袋内有可能提供适宜于Hp定植和生长的微环境。由此可推测通过牙周治疗去除龈上和龈下菌斑，有效破坏龈下生物膜结构，从而彻底有效地去除胃内和口腔内的Hp，减少Hp的再感染机会。因此，慢性胃病患者可通过口腔卫生宣教，控制牙菌斑的形成，从而大大降低Hp的再感染或高发率。    虽然Hp与消化道疾病的关系日益明确，但来自临床事件的大量报告表明：尽管Hp在体外对抗生素敏感，但根除人体内的Hp却十分困难，临床疗效往往不尽人意［8］。    本研究6例胃炎患者经治疗后，用PCR方法仍能从胃内检出Hp。可能原因有：胃内Hp可能使抗生素的抗菌活性降低，影响根除Hp；细菌定植于胃粘膜皱摺内使其逃避了抗生素的杀灭作用。关于胃病患者经抗菌治疗后口腔内Hp的变化情况，以往报道极少，本研究表明，6例患者药物治疗后，发现治疗前72份菌斑中25份（34.7%）Hp阳性，治疗后降至15.3%，说明药物治疗在一定程度上抑制了口腔中的Hp。【参考文献】［1］ Wallence JL. Possible mechanism and mediaters of gastritis associated with Helicobacter pylori infection ［J］. Scand J Gastroenterol,1991,187(Suppl):6566.［2］ Brown LM. Helicobacter pylori;epidemiology and routes of transmission［J］. Epidemiol Rev, 2000,22:283297.［3］ Oderda G. Transmission of Helicobacter pylori infection［J］. Can J Gastroenterol,1999, 13:595597.［4］ Umeda M, Kobayashi H ,Takeuchi Y, et al. High prevalence of Helicobacter pylori detected by PCR in the oral cavities of periodontitis patients ［J］. J Periodontol, 2003, 74(1):12934.［5］ Krajiden S, Fuksa M, Anderson J, et al. Examination of human stomach biopsies ,saliva and dental plaque for Campylobacter polyri［J］. J Clin Microbiol, 1989,27:13971398.［6］ Nguyen AM, ElZaatari FA, Graham DY. Helicobacter pylori in the oral cavity.A critical review of literature［J］. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endond,1995,76:705709.［7］ 胡文杰，曹采方，孟焕新，等. 胃病和牙周病人菌斑中的幽门螺杆菌［J］. 中华口腔医学杂志，1999，34（1）：4951.［8］ Borody T J, Shorts NP, Reyes E. Eradication therapies for Helicobactr pylori［J］. J Gastroenterol，1998,33(suppl X):5356.