变性梯度凝胶电泳分析口腔微生物多样性的研究进展

    作者：谷海晶综述 凌均 审校    作者单位：中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院牙体牙髓病科 广东 广州 510055

    【摘要】  变性梯度凝胶电泳（DGGE）是近些年微生物分子生态学研究中的热点技术之一。由于DGGE技术具有可靠性强、重现性高和方便快捷等优点，被广泛地应用于微生物群落多样性和动态性分析。下面就DGGE的原理、在口腔微生物研究中的应用、优缺点和应用前景作一综述。

    【关键词】  微生物群落； 变性梯度凝胶电泳； 微生物多样性

    Evaluation of oral microbial diversity with denaturing gradient gel electrophoresis  GU Hai-jing, LING Jun-qi. （Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Guanghua College of Stomatology, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510055, China）

    [Abstract]  Denaturing gradient gel electrophoresis（DGGE） is an advanced molecular fingerprinting technique.Because of its objective, rapid and accurate assessment character, DGGE has extensively been used on assessment of the diversity and changes of bacterial species in the microbial population. This article reviewed the principle, merits and limitations of DGGE technique and also reviewed the latest research in the oral cavity with this novel technique.

    [Key words]  microbial flora； denaturing gradient gel electrophoresis； microbial diversity

    微生物的多样性是指在一个集合群落中，众多不同类型微生物的变化以及它们之间相对的丰度。分析生态系中微生物群体的多样性和群落结构的经典方法是分离、培养和鉴定，需要进行一系列繁杂的形态特征和生理生化试验。这种方法最大的缺点是，即使最复杂的试验组合也不能对分离物进行精确的鉴定，而且不能反映分离物间的系统发育关系；其次，自然界中只有0.11%～1%的微生物通过常规方法能被培养[1]，而在龋病、牙周病等口腔细菌感染性疾病中，相当一部分细菌无法培养[2]。因此，人们不能利用传统的微生物技术获得微生物多样性的真正概貌。近年来，逐步发展起来的分子生物学手段可避免经典微生物技术在多样性研究中的局限性，可更可靠、更直接地反映微生物多样性在生态系中的原始构成。这些分子生物学方法包括（G+C）%、16SrDNA序列分析、变性梯度凝胶电泳（denaturing gradientgel electrophoresis，DGGE）、温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）等。

    1  变性梯度凝胶电泳原理

    DGGE技术是由Fischer等[3]于1979年提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术。1993年，Muyzer等[4]将DGGE技术应用于微生物生态学研究，证实了该技术在研究自然界微生物群落的遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性。DGGE通过核酸信息对微生物群落进行表征，较传统的菌种分离培养技术更快捷并能鉴定出不可培养细菌。所以与传统方法相比较，DGGE技术能够快速、准确地鉴定在自然生态环境或人工生态环境中的微生物种群，进行复杂微生物群落结构演替规律、微生物种群动态、基因定位、表达调控的评价分析。由于DGGE具有可靠性强、重现性高和方便快捷等优点，因此在短短的10年内成为微生物群落遗传多样性和动态分析的强有力工具，被广泛用于生物膜、土壤、海洋等环境样品中的微生物多样性检测和种群演替的研究[5]。DGGE技术检测核酸序列是通过不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度发生空间构型的变化，导致电泳速度的急剧下降，最后在其相应的变性剂梯度位置停滞，经过染色后可在凝胶上呈现为分散的条带。DGGE技术可分辨具有相同大小片段的序列差异，可用于检测单一碱基的变化、微生物群落遗传多样性和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增DNA片段的多态性。DGGE技术主要操作过程如下：1）样品预处理；2）样品DNA或RNA提取和纯化；3）16S rDNA或基因片段的扩增；4）预试验；5）制胶；6）样品的DGGE分析；7）图谱分析；8）条带序列分析。

    2  变性梯度凝胶电泳在口腔微生物研究中的应用

    DGGE指印技术可用来监测口腔唾液和菌斑中微生物菌群的瞬间和发展中的变化。Rasiah等[6]采用DGGE研究不同个体、不同时间口腔唾液和菌斑微生物的改变和差异，结果显示，7年中同一个体菌群尽管偶有一过性改变，但唾液中细菌组成基本保持稳定；另外，不同个体的唾液菌斑中所含微生物菌群也不同。McBain等[7]的研究结果同样显示，唾液菌斑中的优势菌群在不同个体中不同。

    一直以来，龋病被认为是500多种口腔微生物中的一种或数种细菌所导致的感染性疾病[8]，然而有些学者却认为龋病的致病菌不应仅限于数种细菌。细菌培养使人们对龋病致病菌及其动态改变的研究受到限制，而聚合酶链反应-变形梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-based dena－turing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）则可直接检测到口腔中不同细菌标本的各种细菌微生物。Li等[9-10]利用口腔微生物16S rRNA通用引物扩增出所有细菌的16S rDNA的V4～V5区域，DGGE研究结果显示，无龋病者唾液中的细菌种类明显多于患龋者，这可能缘于患龋者口腔中某些细菌生长、繁殖占优势，从而抑制、替代了其他细菌的生长。

    在牙周微生物研究中，Zijnge等[11]在采用PCR-DGGE定性和半定量研究牙周病患者治疗前后1 d和第3个月的龈下菌群结构时发现，牙周治疗后第1天，细菌种类明显减少；而在治疗后的第3个月细菌的种类却明显增多，且这些细菌33%～47%与治疗前的细菌组成不同。研究还发现，真菌的微量细菌金酸盐在健康的牙周组织中很少出现，在牙周病患者治疗前的龈下菌斑中该菌DGGE条带却非常明显，但在治疗后第1天和治疗后3个月条带强度明显减弱。故推测该菌种在牙周感染性疾病中起着重要的作用。

    Siqueira等[12]在采用PCR-DGGE研究无症状和症状明显的根尖周病患者根管中的细菌种类时发现，这两种群体的DGGE图谱不同，且没有一个条带同时出现在所有图谱中。这就表明没有一种细菌可同时出现在所有患者中，即使患者的症状相同，其DGGE图谱也不完全相同。该研究结果还显示，症状明显者的DGGE图谱的条带数目为2～29条，平均数目为12，而无症状者的DGGE图谱条带数目平均为7条。这表明有症状和无症状患者感染根管中的优势菌群有较大差异，且前者的细菌种类多于后者。

    通常导致根管感染的细菌主要为拟杆菌属、螺旋菌属、沃杆菌属、梭杆菌属和放线菌属。Siqueira等[13-14]采用PCR-DGGE技术在感染根管中鉴定出一些新的细菌。结果显示，在50%感染根管中能检测到Flexistipes菌种，且这些菌种分别为螺旋体和deferribacteries及源自Atopobium菌属的细菌。对于口腔中的螺旋体，有些学者采用特异性PCR检测到感染根管中存在大量的口腔密螺旋体，并认为其均属于密螺旋体属[15-16]。但Siqueira等[14]却发现，这些螺旋体并不属于密螺旋体菌种。

    3  变性梯度凝胶电泳技术的缺点和局限性

    理论上讲，只要电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，DGGE技术对于DNA片段的分辨率可以达到一个碱基差异的水平。但Vallaeys等[17]发现，DGGE并不能对样品中所有的DNA片段进行分离，DGGE只能对微生物群落中数量超过1%的优势种群进行分析。此外，不同的试验条件也会导致不同带型的DGGE谱图。这将影响探针的设计和系统发育的分析结果。

    待测样品的预处理过程是DGGE技术能否发挥效能的关键步骤，也是导致试验误差的主要原因。此外，在PCR扩增过程中如何避免优先扩增，使所有模板以均等的概率被扩增，基因组的大小、引物的设计和扩增程序的选择均对扩增后DNA片段的质量和数量产生影响。这些都将间接影响DGGE的分析结果。

    基于16S rDNA扩增的DGGE和克隆技术在分析微生物种群差异方面，如果细菌存在多个rrN操纵子，或者利用简并性引物在PCR中获得的双链DNA片段，则可能夸大群落差异和扩大群落的多态性。此外，DGGE技术不能提供有关微生物活性的信息。

    4  变性梯度凝胶电泳的应用前景

    目前，元基因组学已被应用于海洋和土壤微生物群落的研究[18-19]。DGGE技术可监测复杂环境中特异的功能基因及其表达，为元基因组学研究提供有利的信息和基因筛选方案。此外，DGGE分析获得的核酸序列还可进一步用于荧光原位杂交、DNA芯片和实时定量PCR等技术，为口腔特异种群的快速检测作出贡献。

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