22号染色体长臂近端微片段缺失综合征的遗传学研究

    作者：方绍伟综述 郑 谦审校    作者单位：四川大学华西口腔医院唇腭裂外科 四川 成都 610041

    【摘要】  22号染色体长臂近端微片段缺失综合征是一类以22q11.2的基因缺失为主要特征的遗传性疾病，涉及全身多个器官的异常，但在基因层次上有相同的遗传学基础，表型不同。对其基因学的研究主要集中于极限迪格奥尔临界区域中基因位点的分析，包括tbx-1、hira、UFD1L和pcqap等基因。下文主要就22q11近端微片段缺失综合征的临床和基因学表现以及研究方法等研究状况作一综述，为其深入研究提供参考。

    【关键词】  22号染色体； 缺失综合征； 腭心面综合征

    Progresses on the genetic study of 22q11 deletion syndrome  FANG Shao-wei, ZHENG Qian. （Dept. of Cleft

    Lip and Palate, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）

    [Abstract]  22q11 deletion syndrome is a genetic disease which expresses the micro deletion of the 22q11.2. Its appearance involves multitude organics and contains many syndromes which have different phenotype on the genetics, as the research going on, the main research point is the  minimal DiGeorge critical region, which is consist of tbx-1, hira, UFD1L, pcqap and so on. The research method is maturing, which includes five ways. This review tries to introduction of the research progresses of the currant study and provides the reference for other researchers.

    [Key words]  22q11； deletion syndrome； velo-cardio-facial syndrome

    22号染色体长臂近端微片段缺失综合征（22q11.2 deletion syndrome，22q11.2 DS）是人类最常见的染色体和基因（组）疾病，发生率约为1/4 000，包括迪格奥尔综合征（DiGeorge syndro-me，DGS）、圆锥动脉干异常面容综合征、腭心面综合征（velo-cardio-facial syndrome，VCFS）等疾病[1]，有一系列表型异常。由于其都有相同的遗传学基础，在基因层次上有相似的表现，表型不同，都存在22q11.2基因的缺失，故现在大部分学者将其统称为22q11.2 DS并对其进行了序列研究。

    1  临床表现

    22q11.2 DS包括心脏缺陷、面部畸形、胸腺发育不良、腭裂、低钙血症和第22号染色体基因缺失等。此类患者在精神神经方面尚存在发育缺陷或发育不足，表现为注意力不集中、学习能力低下、双相性精神异常和暴躁等[2-6]。

    2  基因学表现

    22q11.2 DS的遗传学研究主要集中于致病基因的定位和各基因位点的功能分析，22号染色体属G组近端着丝粒染色体，在人类各染色体中DNA含量列倒数第2。其短臂主要为核糖体rna基因等短链重复序列，尚未发现存在蛋白质编码基因；其长臂则富含编码蛋白质的基因。分子遗传学研究显示，约90%的22q11.2 DS患者有一段长3 Mb的典型缺失区域，其中包含约30个基因，而8%的患者缺失一长约1.5 Mb的包含24个基因的较短片段。目前认为，位于缺失片段侧端的低拷贝重复序列导致22q11.2基因缺失的主要原因，是同源染色体近端区域内部交换[7]。

    1995年，Muller对22q11.2的典型缺失区域进行了分析，在大于1.5～3.0 Mb的区域中分离出4个重复序列和30多个基因。重复序列均位于缺失或易位的断点上，而基因则定位于300～600 kb的共同缺失片段即迪格奥尔临界区（DiGeorge critical region，DGCR）中[8-9]。发育不全综合征患者常伴有此区域的缺失。1999年，McQmde等报

    道了1名腭心面综合征患者只存在远离IVIEX3CR区的缺失，缺失的基因包括T-bar-1基因和儿茶酚胺氧位甲基移位酶，并认为这两个基因在决定患者临床表型中可能发挥作用。

    为研究22q11.2典型缺失区域的特性，Edel-man对VCFS患者运用物理绘图的方法分离出跨越断点区间的低重复序列（1ow-copy-repetitive，LCR），并将其命名为VCFS-REPS，现在又称其为LCR22。无论是近端或是远端的VCFS-REPS都包含一个由一纵列环绕断点的基因、假基因等组成的约200 kb的复杂区域。LCR22在减数分裂期间发生同源重组时出现不对称和异常，可能介导了基因缺失的发生。Baurner等在10名正常、8名22q11易位、2名缺失被试者中均发现父源等位基因被优先非随意的异步复制，这种复制方式产生了减数分裂时的不平衡交换，可能是引起22q11 DS的原因[10]。1993年，Haltom等提出了导致该病临床异常表现的长约500 kb的最短缺失重复区域。1994年，引起DGS和（或）VCFS表型所必需的区域被缩小到了250 kb，被称为极限迪格奥尔临界区域（minimal DiGeorge critical region，MDGCR），这为以后的进一步研究奠定了基础。

    目前，22q11.2 DS基因研究的热点主要包括tbx-1、hira、UFD1L（ubiquity fusion degradation-1-like）和pcqap（pc2 glutamine/Q-rich-associatedprotein）等数个关键基因[11]，其中tbx-1基因最为主要。

    2.1  tbx-1基因

    tbx-1基因属于T-box转录因子家族，该家族基因在种系发生和进化过程中趋于保守，因其成员都包含一个相同的DNA结合域，即T.box而得名。在人类，tbx-1作为22q11.2 DS候选基因的证据来自于1名有相应表型的患者，其750 kb的微小缺失范围内包含tbx-1和儿茶酚胺氧位甲基移位酶基因。2003年，Yagi等在用N25探针对235例临床诊断为22q11.2 DS的患者染色体进行荧光原位杂交时发现，有225例1.5～3.0 Mb片段缺失。继续在无基因缺失的患者中检测tbx-1基因所有外显子时发现，有5例存在3个突变位点，其中2例散发，分别为错义突变F148Y和G310S，都是进化上保守的区域。另外3例来自一个家庭，该位置碱基缺失1223delC可能形成移码突变并进一步造成Tbx-1蛋白C末端区域缺失。tbx-1基因在人体发育中的作用主要有参与胚胎早期咽弓动脉的形成，参与神经嵴细胞的正常迁移过程，参与心脏流出道的发育[12]。

    2.2  hira基因

    hira基因种属间高度保守，编码一个含1 018个氨基酸的转录蛋白。该蛋白有7个WD40重复功能区，形成螺旋状结构，在细胞周期中与细胞周期蛋白、CDK-2结合，第555位脯氨酸被其磷酸化，参与细胞周期的调节。

    2.3  UFD1L基因

    UFD1L是一种酵母基因同源物，从酵母到人类该基因高度保守，有12个外显子，在5′端存在不同的转录起始位点D51。UFD1L基因在第1到第4咽弓的尖端高表达，尤其是在腭原始部位和额鼻部高表达。UFD1L基因编码参与遍在蛋白水解的高度保守的遍在蛋白降解酶Ⅰ。UFD1L基因在胚胎组织中的表达，可影响神经嵴细胞、腭咽弓和心脏流出道等。Lindsay运用基因敲除鼠模型证实，UFD1L基因缺失可引起锥干型心脏畸形；对于哺乳动物，UFD1L蛋白与Np14形成与p97结合的二聚复合体，此种蛋白参与高尔基膜分裂后期的融合。Yamagishi等用表达UFD1L蛋白的反转录病毒感染迁移前的神经嵴细胞，研究鸡胚屏蔽UFD1L蛋白后的效果，得出了相似的结论。UFD1L蛋白可作为一种修饰因子使22ql1 DS表型变异增大，体现在室间隔缺损、甲状腺和甲状旁腺发育不良、行为和精神异常等[13]。

    2.4  pcqap基因

    pcqap基因编码的Pcqap蛋白是多蛋白复合体PC2的亚单位，在RNA聚合酶Ⅱ介导的转录过程中起协助作用。Pcqap蛋白广泛分布在各种组织中，在咽弓、肢芽和额鼻处高表达，在22q11微缺失患者中该基因缺失。DeLuca等发现，精神分裂症者的第7外显子与健康人存在差异，推测pcqap基因与精神分裂症易患性有关[14]。 

    3  研究方法

    3.1  连续克隆法

    22号染色体DNA测序主要采用连续克隆的方法，即将整个基因组切割成100～200 kb大小的DNA片段，然后将这些片段插人细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）或P1人工染色体（P1 artificial chromosome，PAC）以构建重组体，经过BAC和PAC文库的筛选和鉴定，获得基因组DNA各个克隆序列，再根据限制酶指纹图谱和序列标签位点将相互交错的克隆组装和连接起来，获得完整的基因组序列。    

    3.2  荧光原位杂交法

    荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是检测22q11微缺失的常用方法。即利用22号染色体上DGCR制成的探针进行杂交，用荧光作为检测系统进行检测的一种方法。FISH技术既具有分子杂交的高度特异性和敏感性，又能在染色体原位显色且定位准确，结果稳定直观，所需标本少，故成为检测22q11微缺失的金标准。其不足之处在于DNA探针的高度特异性，一种探针只能检测某一个位点，而不能同时观察其他染色体或位点的异常[15]，故不属于DNA探针范围内的缺失可能会漏诊；另外，需行细胞培养和杂交且检测时间长，操作复杂；其三成本较高，其广泛应用受到了一定的限制。

    3.3  聚合酶链反应法

    聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种检测22q11微缺失方便、低成本、时间短且可靠的技术[16-17]。但是，该方法必须要有患者父母的DNA样品作对照，而且其扩增产物为单一条带者，不能判别是否存在22q11微缺失。因为除了可能发生缺失外，还有纯合子基因型的可能；有时候选取的3个微卫星标记不能得出有效的结果时，还须选取更多的微卫星标记，增加了成本和工作量。

    3.4  实时荧光定量聚合酶链反应法

    实时荧光定量PCR是新近发展起来的一种能准确量化PCR产物的新技术，在某种程度上不受扩增反应成分轻微变化的影响。2001年，Kariya-zono等用其快速地检测出22q11微缺失，和FISH检测的相符率达99%±7%。该技术快捷、简便、成本低廉。该技术与PCR相比较，首先不需要患者父母的DNA样品作对照；其次，判断结果较可靠；可确诊多重PCR不能确定的病例。但该技术不能检测出染色体的嵌合现象和平衡易位[17-18]，所需要的仪器设备也比较昂贵。

    3.5  比较基因组杂交法

    比较基因组杂交（comparative genomic hybri-dization，CGH）法是在FISH基础上结合消减杂交技术于20世纪90年代发展起来的一种新的分子细胞遗传学技术，可以快速、系统地检测整个基因组内染色体的获得与丢失。由于DGS和（或）VCFS是一种异源性的基因缺失，故有10%～15%的有典型症状的患者并没有DGCR-1的缺失。Bearden等[19]发现，引起DGS和（或）VCFS的遗传学原因不仅仅在于22号染色体长臂上有基因的缺失，还有可能在10号染色体短臂上和4号染色体长臂上有基因的缺失。

    综上所述，尽管22q11微缺失综合征的研究正在逐步深入，新的研究方法也不断地被采用，然而其中尚存在着较多悬而未决的问题，尤其是其基因的具体作用仍然存在着分歧，期待在此以后的研究中能使之得到解决。

【参考文献】[1] Oskarsdóttir S, Vujic M, Fasth A. Arch Dis Child, 2004, 89（2）：148-151.

[2] Arnold PD, Bartelt JS, Cytrynbaum C, et al. Am J Psychiatry, 2001, 105（4）：354-362.

[3] Antshel KM, Conchelos J, Lanzetta G, et al. Psychiatry Res, 2005, 138（3）：235-245.

[4] Oskarsdóttir S, Belfrage M, Sandstedt E, et al. Dev Med Child Neurol, 2005, 47（3）：177-184.

[5] Morton NE. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991, 88（17）：7474-7476.

[6] Lajiness-O′Neill RR, Beaulieu I, Titus JB, et al. Child Neuropsychol, 2005, 11（1）：55-71.

[7] Saitta SC, Harris SE, Gaeth AP, et al. Hum Mol Genet, 2004, 13（4）：417-428.

[8] Singh SM, Murphy B, O′Reilly R. J Med Genet, 2002, 39（11）：71.

[9] Cuneo BF. Curr Opin Pediatr, 2001, 13（5）：465-472.

[10] Liu H, Abecasis GR, Heath SC, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99（26）：16859-16864.

[11] De Luca A, Conti E, Grifone N, et al. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 2003, 116（1）：32-35.

[12] Arnold JS, Werling U, Braunstein EM, et al. Development, 2006, 133（5）：977-987.

[13] Liao J, Kochilas L, Nowotschin S, et al. Hum Mol Genet, 2004, 13（15）：1577-1585.

[14] Bish JP, Ferrante SM, McDonald-McGinn D, et al. Dev Sci, 2005, 8（1）：36-43.

[15] Kitsiou-Tzeli S, Kolialexi A, Fryssira H, et al. In Vivo, 2004, 18（5）：603-608.

[16] 王大仁, 邓春富, 谭学新, 等. 华西口腔医学杂志, 1999, 17（2）：131-132.

[17] 杨怀涛, 周志瑜, 杨秀英, 等. 华西口腔医学杂志, 1994, 12（2）：212-214.

[18] Simon TJ, Bearden CE, Mc-Ginn DM, et al. Cortex, 2005, 41（2）：145-155.

[19] Bearden CE, van Erp TG, Monterosso JR, et al. Neurocase, 2004, 10（3）：198-206.