口腔链球菌果糖基转移酶的分子结构和调控机制

    作者：仇元新综述 胡 涛审校    作者单位：口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学 四川 成都 610041

    【摘要】  果糖基转移酶是口腔细菌细胞外多糖合成酶之一，它以蔗糖为底物催化合成果聚糖。口腔链球菌果糖基转移酶是口腔重要的致龋蛋白之一。笔者下面就果糖基转移酶的分子结构、反应机制和编码基因及其调节作一综述。

    【关键词】  果糖基转移酶； 果聚糖； 分子结构； 反应机制

    AMolecular structure and regulation mechanism of fructosyltransferase in oral Streptococci  QIU Yuan-xin,  HU Tao. （State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China）

    [Abstract]  Fructosyltransferase is a kind of enzyme, which catalyzes the synthesis of fructan when sucrose is present at environment. The fructosyltransferase of oral Streptococci acts as one of its important cariogenic proteins. The article reviewed the molecular structure, reaction mechanism, coding gene and regulation mechanism of  fructosyltransferase.

    [Key words]  fructosyltransferase； fructan； molecular structure； regulation mechanism

    果糖基转移酶（fructosyltransferase，FTF）是口腔重要的致龋蛋白之一[1-2]，是由口腔细菌合成并分泌到细胞外的一种固有酶，可由变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）、唾液链球菌（Streptococcus salivarius，S. salivarius）和黏性放线菌（Actinomyces viscosus，A.viscosus）等产生[3]。FTF和芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）的果聚糖蔗糖酶组成了一个酶家族，包括合成左旋糖酐的左旋糖蔗糖酶（levansucrase）和合成菊粉型果聚糖的菊粉蔗糖酶（inulosucrase）。芽孢杆菌和变异链球菌的FTF直接分泌到培养液中，而唾液链球菌[4]的FTF最初以细胞结合的形式存在，当其底物（蔗糖）存在时，结合的FTF就会释放到培养基中。

    1  果糖基转移酶的分子结构

    FTF的分子结构由信号肽、N端可变区、催化核心区、C端可变区（有时含胞壁结合域）组成。

    1.1  信号肽和N端可变区

    Shiroza等[5]在对变异链球菌GS-5的FTF氨基酸分析中发现，FTF起始部有一长的信号肽序列（前34个氨基酸残基），其中前14个氨基酸高度保守，其后紧接一高度疏水区。信号肽的作用在于该酶的细胞外分泌，革兰阴性细菌的信号肽前体在分泌的过程中被剪切掉。不同细菌的N端可变区大小不同，目前的研究认为其作用不大。

    1.2  催化核心区

    1.2.1  催化残基  催化核心区是由5个折叠的β-螺旋组成中心带负电荷的袋状结构，主要由高度保守的氨基酸残基组成，包括一些不变的酸性氨基酸，例如86和247位的天冬氨酸（aspartic acid，Asp）及342位的谷氨酸。

    1.2.2  催化位点  对底物具有剪切作用的酶结构位于－1～＋1亚位点之间，酶的－1位点和剪切下的底物共价结合形成酶-底物中间体，之后底物与酶解离并与受体分子（如果聚糖）结合。－1位点的氨基酸组成相对保守，而＋1位点的氨基酸组成则变化较大，且革兰阳性和革兰阴性细菌的FTF分子的＋1位点的氨基酸组成不同。

    1.2.3  影响产物形成的突变  催化核心区的数个保守的氨基酸残基对FTF的功能至关重要，FTF的2个高度保守区被称为蔗糖结合盒（sucrose binding box，SBB）。唾液链球菌ATCC 25975的FTF的SBB-1和SBB-2之间的Asp312参与受体识别或β-转角的稳定。发生于SBB的点突变导致FTF的催化效率明显改变[5]。芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的第331位精氨酸（arginine，Arg）突变导致FTF活性的变化，如果该氨基酸被赖氨酸、丝氨酸和亮氨酸中的任何一个取代，将使FTF失去合成果聚糖的能力而只能合成蔗果三糖。Yanase等[6]通过对芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的三维结构分析发现，该酶第331位氨基酸残基Arg参与构成FTF的受体结合位点。

    1.2.4  钙结合位点  Meng等[7]通过对芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶的三维结构的分析还发现，该三维结构存在着钙离子结合位点，其中Asp339是钙离子结合残基之一。唾液链球菌ATCC 25975的果聚糖蔗糖酶活性也有赖于钙离子的存在[8]。革兰阳性细菌的果糖基转移酶钙离子结合位点的氨基酸高度保守，在革兰阴性细菌中则没有这样的结构[9]。

    1.3  C端可变区

    C端可变区会影响酶产物的大小和酶的特异性，也可介导FTF吸附于相应的菌体表面。产生这一作用的原因，是该区含有细胞壁结合基序LPXTG。在唾液链球菌ATCC 25975的果聚糖蔗糖酶中，同样存在着类似的结构[10]。吸附于细菌表面的FTF合成的吸附性多糖参与细菌对牙面的黏附[11]。

    2  果糖基转移酶的反应机制

    细菌FTF水解蔗糖（底物）的糖苷键，并利用其释放的能量将游离的果糖偶联至相应的受体上，这些受体包括正在延长的左旋糖酐或菊粉等果聚糖链、蔗糖和水及其他（如棉子糖）。由于蔗糖是初始活化反应的受体，因此细菌果聚糖在链的一端含有一个非还原葡萄糖。

    FTF催化合成新的果聚糖分子，后者又可以作为该反应的底物受体。因此，有学者提出了多链延长机制[12]：在该反应中，果糖残基随机加入所有的果聚糖受体分子中，不包括水的果糖基受体的性质随反应的进行而变化，合成的低分子质量的果聚糖会加速多糖的形成并增加果聚糖或游离果糖的比例[13]；在进一步的反应中，一个果糖单位加入到一个受体分子中。大多数FTF的水解和转移反应遵循米氏动力学，其催化反应为两步进行。首先，FTF与底物共价结合形成酶-底物中间体；之后，底物与FTF解离并与果聚糖等受体分子结合。FTF的酸性基团和亲核基团为转果糖基反应的必须基团。其中，亲核基团和果糖结合形成底物-酶中间体。Steinberg等[14]发现，变异链球菌FTF的聚合活性和寡聚活性的调节方式不同，推测其反应机制可能涉及2个活性位点。

    3  ftf基因及其表达调控

    FTF由单一ftf基因编码。Shiroza等[5]在对变异链球菌GS-5的ftf基因序列分析中发现，GS-5的结构基因始于第681位的起始密码子ATG，止于第3 072位的终止密码子TAA；GS-5的完整基因编码797个氨基酸的蛋白质，推测其相对分子质量为8.76×104。ftf基因上游有471～518位和565～593位两段反向重复序列，可能是其调节区。Kiska等[15]发现，这两个反向重复序列之间的基因缺失会导致ftf基因转录水平下降40%，在ftf基因617～645位的上游还存在着一启动子样的序列，即ATGATA-N17-TAGGAT，该序列类似于大肠杆菌的共有序列TTGACA-N17-TATAAT。在ftf基因下游3 150～3 179位也存在的一反向重复结构，可能是ftf基因的转录终止子。对FTF高产菌株变异链球菌V-403的基因序列分析表明，其基因上游的数个核酸序列改变是导致其产生较多FTF的原因。

    Shiroza等[5]在变异链球菌GS-5的FTF结构基因的两侧还检测出4个开放读码框（ORF1～4）。其中，ORF1和ORF2位于ftf结构基因的上游，ORF3和ORF4位于其下游。与其他ORF不同的是，ORF3又名frp基因，其转录方向与ftf基因的转录方向相反，起始于3 951位的ATG，终止于3 267位的TAA，编码一种228个氨基酸、相对分子质量为2.65×104的多肽，在其前方－35和－10处有启动子序列（TTGCAA和TATAAA）。在

    3 956位存在一潜在的S-D序列，与3 958至3 978位的反向重复序列部分重叠，提示该反向重复序列可能参与调节ORF3的表达。frp基因产物的部分氨基酸序列与革兰阳性细菌的DNA结合蛋白-σ37亚单位、SpoOF、PhoP和PenI等蛋白具有一定的同源性，因此推测其可能参与FTF的表达调节。Shibata等[16]发现，frp基因的编码蛋白FRP特异性地与ftf基因启动子上游565～593位的反向重复序列结合，从而可能调节FTF的表达。Wang等[17]在进一步研究中发现，FRP蛋白正向调节FTF的表达，变异链球菌GS-5的frp基因失活株的ftf基因转录、FTF表达及其活性均下降。此外，FRP还可正向调节葡糖基转移酶（glucosyl transferase，gtf）B基因的转录表达和GtfB的活性。

    除FRP之外，VicRK双组分信号转导系统、RegM蛋白和糖磷酸转移酶运送系统（phosphotra-nsferase transport system，PTS）均参与调节ftf基因的表达。VicRK系统由位于细菌细胞膜上的组氨酸激酶感受器VicK和位于细胞质中的调节器VicR组成，其中VicK感知环境变化，VicR调节基因表达。VicRK由操纵子vicRKX编码，其中vicR编码调节蛋白VicR，vicK编码感受蛋白VicK，vicX编码VicX。

    Lee等[18]应用抗FTF抗体探针检测到covR突变株的FTF表达水平为野生株的3倍，从而认为CovRS（即VicRK）负向调节FTF的表达且其作用发生在ftf基因转录水平。Senadheera等[19]则认为，VicRK正性调节ftf的表达，变异链球菌UA159的vicK突变株（SmuvicK）的ftf基因表达降低，而其vicRKX过表达株（Smuvic+）的ftf基因表达明显上升。他们认为，这一作用是通过VicR与ftf启动子区结合来实现的。RegM是变异链球菌调节蛋白家族成员之一，与其他革兰阳性细菌如芽孢杆菌的代谢物控制蛋白（catabolite control protein，Ccp）-A属同一家族。Browngardt等[20]通过研究认为，变异链球菌RegM为ftf基因正常表达所必需，失活会导致ftf基因表达下调，其作用机制可能是通过与启动子区直接结合实现的，也可能是通过影响PTS的磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyr-uvate，HPr）的磷酸化状态来实现的，其确切机制有待于进一步的研究。Abranches等[21]发现，PTS的组分之一EIIABMan也会影响ftf基因的表达，在pH值为7、葡萄糖受限的环境中，EIIABMan缺陷株的ftf基因表达较野生株增加2.1倍，其机制可能缘于FTF调节蛋白的磷酸化或其对基因正常转录所需因子的调节。

    ftf基因的表达受环境因素影响较大。细菌的生长速率、糖源和环境pH值都会影响ftf基因的表达，但其机制尚不清楚。Hudson等[22]发现，蔗糖可诱导ftf基因的表达，但随时间延长这种诱导作用逐渐消失。Kiska等[15]认为此现象的产生，是葡萄糖和果糖等反应产物对蔗糖诱导的ftf基因的表达有抑制作用。他们还在糖源影响ftf基因表达机制的研究中发现，ftf基因启动子上游的两个反向重复序列之间的基因序列缺失会导致ftf基因转录水平下降40%，但蔗糖的诱导作用不受影响，即该区参与控制ftf基因转录但与糖原调节的ftf基因表达无关；而第二个反向重复序列（565～593位）的缺失，则导致ftf基因转录和蔗糖诱导作用均消失。该研究说明，糖类并非作用于ftf基因的转录调节区并发挥作用。参与糖类调节的基因序列在ATG起始密码子135 bp以内，其中包括第二个反向重复序列。有关变异链球菌GS-5和V-403在蔗糖和葡萄糖为糖源的培养基中ftf基因表达水平的比较显示，除顺式作用元件外还存在一反式作用因子参与调节其表达，这一因子在变异链球菌V-403中缺失或发生改变，导致其ftf基因表达不受糖类的影响。此外，糖类对ftf基因表达的调节也会通过PTS发挥作用[21]。

    综上可见，作为变异链球菌细胞外多糖合成酶基因之一的ftf基因的表达受多种内源性和外源性因素的调解，这些因素之间可能存在着相互作用，其复杂的作用机制有待于进一步的研究。

    4  结束语

    FTF是口腔细菌重要的致龋因子之一，其合成的果聚糖可促进龋病的发生和发展，且其开放读码框ORF3的产物可调节ftf基因和gtf基因的表达。因此，可望通过FTF途径控制细菌胞外多糖，进而影响龋病的发生发展。

【参考文献】  [1] Schroeder VA, Michalek SM, Macrina FL. Infect Immun,1989, 57（11）：3560-3569.

[2] Munro C, Michalek SM, Macrina FL. Infect Immun, 1991, 59（7）：2316-2323.

[3] 赵 今, 李继遥, 朱 昞. 华西口腔医学杂志, 2006, 24（6）：546-550.

[4] 谢 倩, 李继遥, 左渝陵. 华西口腔医学杂志, 2005, 23（1）：82-84.

[5] Shiroza T, Kuramitsu HK. J Bacteriol, 1988, 170（2）：810-816.

[6] Yanase H, Maeda M, Hagiwara E, et al. J Biochem, 2002, 132（4）：565-572.

[7] Meng G, Fütterer K. Nat Struct Biol, 2003, 10（11）：935-941.

[8] Jacques NA. Carbohydr Res, 1984, 127（2）：349-355.

[9] Ozimek LK, Euverink GJ, van der Maarel MJ, et al. FEBS Lett, 2005, 579（5）：1124-1128.

[10] Rathsam C, Jacques NA. JBacteriol, 1998, 180（23）：6400-6403.

[11] Rozen R, Bachrach G, Bronshteyn M, et al. FEMS Micr-obiol Lett, 2001, 195（2）：205-210.

[12] Chambert R, Treboul G, Dedonder R. Eur J Biochem,1974, 41（2）：285-300.

[13] van Hijum SA, van der Maarel MJ, Dijkhuizen L. FEBS Lett, 2003, 534（1/3）：207-210.

[14] Steinberg D, Rozen R, Bromshteym M, et al. Carbohydr Res, 2002, 337（8）：701-710.

[15] Kiska DL, Macrina FL. Infect Immun, 1994, 62（4）：1241-1251.

[16] Shibata Y, Kuramitsu HK. FEMS Microbiol Lett, 1996, 140（1）：49-54.

[17] Wang B, Kuramitsu HK. Infect Immun, 2006, 74（8）：4581-4589.

[18] Lee SF, Delaney GD, Elkhateeb M. Infect Immun, 2004, 72（7）：3968-3973.

[19] Senadheera MD, Guggenheim B, Spatafora GA, et al. J Bacteriol, 2005, 187（12）：4064-4076.

[20] Browngardt CM, Wen ZT, Burne RA. FEMS Microbiol Lett, 2004, 240（1）：75-79.

[21] Abranches J, Chen YY, Burne RA. Appl Environ Micro-biol, 2003, 69（8）：4760-4769.

[22] Hudson MC, Curtiss R 3rd. Infect Immun, 1990, 58（2）：464-470.