高温需要A蛋白与口腔变异链球菌的致龋性

    作者：李静综述 刘兴容审校    作者单位：泸州医学院附属口腔医院口腔内科 四川 泸州 646000

    【摘要】  变异链球菌是龋齿的主要致病菌，细菌表面多糖合成物、对牙面的黏附聚集、生物膜形成是其重要的生理学致病因子。高温需要（Htr）A是一种细菌细胞质的热休克蛋白，对于细菌耐受环境变化，特别是温度的增高，pH值和氧化还原电势的变化有重要的意义。下面就HtrA与变异链球菌致病因子相关的研究进行综述。

    【关键词】  变异链球菌； 高温需要A蛋白； 表面蛋白； 生物膜

    ARelationship between high temperature requirement A and dental caries caused by Streptococcus mutans  LI Jing, LIU Xing-rong. （Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Hospital of Stomatology, Luzhou Medical College,Luzhou 646000, China）

    [Abstract]  Streptococcus mutans（S.mutans） is known as a primary pathogen of dental caries, and its exopolysaccharide synthesis, adherence to tooth surface and biofilm formation is important physiological and virulence factor of S.mutans. High temperature requirement A（HtrA） is a periplasmic heat shock protein, which reduces the ability to withstand high temperature, extreme of pH and oxidative stress. This article reviewed the relationship between HtrA and virulence factors of S.mutans.

    [Key words]  Streptococcus mutans； high temperature requirement A； surface protein； biofilm

    变异链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）作为人类龋病主要的致病菌和致龋生物膜形成的必需细菌，在人类口腔中占有重要的生态地位，具备了在牙面定植的多种特性，是牙菌斑生物膜的重要组成成分，也是致龋生物膜中数量较多的细菌之一。    高温需要A（high temperature requirement A，HtrA）蛋白是细菌体内一种热休克蛋白质分子，为丝氨酸蛋白酶家族成员。HtrA在细菌的耐热特性中发挥着重要的作用，当环境温度正常时作为分子伴侣存在，当环境温度升高时则作为蛋白酶参与细胞质内异常蛋白的降解。HtrA的作用多表现为帮助细菌逃避大体积分数的氧气以及高温和高渗等环境变化，并使折叠错误的蛋白分子重新折叠或发生降解[1-2]。

    1  HtrA的功能区和生物学作用

    HtrA存在于多种革兰阴性和阳性细菌中，其相对分子质量约为5.0×106，具有氨基端的基因序列丙氨酸-缬氨酸-脯氨酸-丝氨酸（Ala-Val-Pro-Ser，AVPS）、中心的丝氨酸蛋白酶功能区和C端的PDZ等3个主要结构域[3]。AVPS可与X染色体连锁程序性细胞死亡抑制蛋白结合，发挥其促程序性细胞死亡作用。丝氨酸蛋白酶功能区（150～343位氨基酸残基）空间折叠方式与胰蛋白酶相同，其中组成催化三联体的氨基酸包括组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸残基（His198、Asp228和Ser306）通过氢键结合在一起。PDZ结构域因含有PSD-95、Dlg和ZO-1等基本蛋白而得名，主要的功能是调节蛋白酶活性。

    PDZ结构域C端的β-链（β-18）与其他PDZ结构域中最靠近N端的β-链相一致，PDZ结构域具有肽结合槽，可与催化区的袢状结构结合，以阻止底物与蛋白酶活性区的结合。PDZ结构域还具有调节蛋白质相互作用的功能，它通过蛋白酶结构域间的相互作用形成一个倒金字塔型的同型三聚体，在倒金字塔型的HtrA2/Omi三聚体中，蛋白酶结构域位于顶部，而PDZ结构域则向外突出。PDZ结构域具有高度可移动性，游走于蛋白酶结构域的四周，以捕获底物分子，一旦与底物结合便在内部形成一个狭窄的通道，将底物送入倒金字塔内的蛋白水解位点。因此，PDZ结构域能够选择性地与靶蛋白C端的残基结合以介导特异性的蛋白-蛋白相互作用，PDZ结构域是底物进人HtrA核心活性部位的唯一通路，与何种底物结合以及是否发挥蛋白酶作用都由PDZ结构域决定[4]。

    在革兰阳性菌中，HtrA参与了许多具有致病性的表面蛋白的合成。HtrA另一个显著的特点就是其蛋白酶活性具有可逆调控功能，它可通过几何结构排列的催化三联体，保证从分子伴侣到蛋白酶的可逆转变，有利与细菌对外界环境的改变作出迅速应答[5]。此外，最近的研究[6-7]证实在细胞程序性细胞死亡过程中，HtrA2具有一定的调控作用，有利于去除过多的、受损伤的和受感染的细胞，可能具有重新折叠或降解线粒体中折叠错误的蛋白质功能，并可促进程序性细胞死亡的发生。

    2  几种非致龋细菌的HtrA及其功能

    2.1  肺炎链球菌的HtrA及其功能

    1998年，Gasc等在肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae）中发现了HtrA，且被CiaRH双组分信号系统调控[8]。HtrA在一次使用信号标签诱变技术的筛选中被认为是肺炎链球菌的毒力因子。Ibrahim等[9]在小鼠模型研究中发现，htrA基因缺失可使肺炎链球菌的致病性降低，在高温条件下生长减慢但可提高其氧化应激敏感性。当HtrA的表达增加后，肺炎链球菌的生长表型和降低的毒性都会得到恢复。Sebert等[10-11]发现，HtrA的活性对于CiaRH双组分信号系统抑制感受态具有重要的作用，CiaRH双组分信号系统的激活可阻止肺炎链球菌基因转化过程中感受态的产生，而HtrA的表达也受到CiaRH双组分信号系统的调控。

    2.2  大肠杆菌的HtrA及其功能

    Farn等[12]在对大肠杆菌的研究中发现，HtrA蛋白家族由DegP、DegQ和DegS组成，其蛋白酶区域具有高度的同源性。DegP和DegQ包含2个PDZ结构域，而DegS只有1个PDZ结构域。此外，DegP还具有一个被称为Q链接的区域，DegP仅于低温条件下呈现分子伴侣的活性，而其蛋白水解活性在32～42 ℃条件下迅速增加，因此认为DegP具有温度依赖性的调节功能。DegQ则是DegP过表达时的功能代替物，它既不是热诱导，也与正常条件下细胞的生长无关。DegQ与DegP一样具有底物特异性，并且在P1位点识别Val/Xaa和lle/Xaa。DegQ可能在蛋白质质量控制中起重要的作用，并且涉及依赖温度调控的分子伴侣与蛋白酶作用的相互转变。

    DegS的PDZ结构区域可通过识别外膜蛋白C端的氨基残基调节细胞的应激反应。DegP的2个PDZ结构区域起着蛋白水解活性调节器的作用，与何种底物结合以及是否发挥蛋白酶作用都由它决定，起类似蛋白水解活性的看门人作用[13-14]。

    Kim等[15]在通过对DegP、DegQ和DegS等3种HtrA蛋白的结构和生化检查以及对HtrA在蛋白质质量控制中的作用进行的比较分析中发现，DegP和DegQ包含2个PDZ结构域，而DegS只有1个PDZ结构域。但其基本功能都是通过PDZ结构域和一种温度依赖性转换机制，从分子伴侣到蛋白酶实现其功能，这种机制也可经过识别酶作用底物精细调整其功能。

    2.3  金黄色葡萄球菌和乳酸乳球菌的HtrA及其功能

    Rigoulay等[16]在对金黄色葡萄球菌的研究中发现，htrA基因突变体可影响不少致病因子的分泌和表达并调节致病因子及弹力蛋白的表达，而且通过控制有关细菌活动性的细胞外因子的产生间接影响其致病性。Poquet等[17]在对乳酸乳球菌的研究中发现，HtrA作为细胞外蛋白酶可降低异常蛋白的产生，在天然蛋白前体的前肽处理阶段和天然蛋白的成熟过程中起着不可替代的作用。

    3  变异链球菌的HtrA及其作用

    3.1  HtrA在变异链球菌表面蛋白表达中的作用

    口腔变异链球菌要在口腔环境中生存定植，必须适应复杂多变的口腔环境。变异链球菌表面蛋白的遗传多态性与其黏附性能有关[18]。为适应口腔温差瞬间的变化，变异链球菌会发生热休克反应并产生热休克蛋白。Svens?覿ter等[19]通过双相凝胶电泳证实，变异链球菌在经历2 h、42 ℃时的热休克反应后，会有新的蛋白质表达。变异链球菌的7种不同的细胞外或细胞壁相关蛋白皆属于htrA基因调控表达，而且失活的HtrA蛋白酶对其没有降解作用[20]。

    革兰阳性菌的HtrA表面蛋白酶参与细胞外蛋白的处理和成熟过程，并对异常或错误折叠的蛋白质进行降解。Biswas等[21]认为，HtrA可能影响变异链球菌糖酵解有关的细胞外酶从而进一步影响变异链球菌生物膜的形成能力，最终导致变异链球菌对外界温度变化的适应能力下降。研究发现，敲除htrA基因的变异链球菌，对过低或过高温度、低pH值、氧化剂和DNA损坏剂的耐受能力降低。htrA基因突变造成一些细胞表面蛋白，譬如葡聚糖结合蛋白-B、葡糖基转移酶和果糖基转移酶等表达受到影响。此外，突变的htrA基因也改变了烯醇酶、脱氢甘油醛-3-磷酸这2种糖酵解酶的链状球菌细胞表面蛋白的表达。热休克蛋白能保护变异链球菌适应复杂的环境变化，即HtrA在细胞外表面蛋白如糖酵解酶生成以及生物膜的形成中扮演着重要的角色。

    3.2  HtrA在变异链球菌生长和生物膜形成中的作用

    变异链球菌的初始黏附能力可能与龋病的发生有关[22]。htrA基因的失活可影响细菌对热量和环境应激的耐受性，同时可降低细菌的毒力。Ahn等[23]证实，HtrA在变异链球菌的遗传转化中起着控制生长和反应能力的重要作用。通过感受态刺激多肽的作用可使htrA基因的表达增加。htrA基因的缺失可造成变异链球菌在37 ℃环境下缓慢生长，42 ℃环境下热耐受性降低，改变其生物膜的形成能力。另一种基因spo0J，位于htrA基因的下游区，可影响变异链球菌的遗传转化。htrA和spo0J基因可通过单转录和共转录作用，对感应反应产生影响。HtrA是调控网络结构中的重要组成部分，与细胞生长、应激耐受力、生物膜形成和反应能力有关，并影响spo0J基因在遗传转化中作用。另外，在对体外生物膜的微观分析中发现，htrA基因缺陷的菌株所形成的菌落相对于正常野生型菌株的光滑菌落，更多的呈现颗粒斑块状。Svens?覿ter等[19]发现，变异链球菌的htrA基因缺陷失活后，其在液体培养基中生长聚集，菌落的形态发生改变，失去耐高温、抗pH值和氧化应激的能力。

    4  结束语

    HtrA作为细菌的一种热休克蛋白，直接或间接地影响口腔变异链球菌的聚集及其生物膜的形成。虽然其机制尚不清楚，但无论在理论上还是在实践上，目前的有关研究都可为将来进一步的研究打下必要的基础，并且随着研究的进一步深入，对今后人工干预菌斑的形成并达到预防龋病的发生均具有深远的意义

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