间充质干细胞非分化性增殖的研究进展

    作者：孙蕾综述 朱慧勇审校    作者单位：浙江大学医学院附属第一医院口腔颌面外科 浙江 杭州 310003

    【摘要】  间充质干细胞系多潜能干细胞，其多向分化能力具有广泛的临床应用前景。非分化性增殖即指在增殖的同时保持其多向分化潜能。目前，间充质干细胞在增殖过程中仍存在增殖潜力和多向分化潜力逐渐丧失的问题，而人血清、生长因子、细胞外基质培养基、生物反应器和中药等逐渐成为此类研究的热点。下面从间充质干细胞非分化性增殖的意义、问题、方法等就间充质干细胞非分化性增殖的研究进展作一综述。

    【关键词】  间充质干细胞； 增殖； 分化； 多向潜能

    AResearch Progress of undifferentiated proliferation of mesenchymal stem cells  SUN Lei, ZHU Hui-yong.

    （Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, The First Affiliated Hospital, College of Medicine, Zhejiang University, Hangzhou 310003, China）

    [Abstract]  Mesenchymal stem cells are multipotent stem cells, and their multilineage potential holds extensive promise for clinical application. Undifferentiated proliferation means proliferation while maintaining multilineage potential. Nowadays, loss of proliferation potential and multineage potential is still a problem for mesenchymal stem cells while proliferating. Recent studies are focused on human blood serum, growth factor, extracellular matrix medium, bioreactor, traditional Chinese medicine, and so on. This paper reviewed the study progression of undifferentiated proliferation of mesenchymal stem cell from following aspects of significance, puzzlements and methods of undifferentiated proliferation of mesenchymal stem cell.

    [Key words]  mesenchymal stem cell； proliferation； differentiation； multilineage potential

    间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）以多向分化潜能和极强的可塑性，在组织工程、基因治疗和免疫治疗方面有着巨大的应用前景。骨髓是MSC的主要来源之一，但MSC在人类骨髓细胞中仅占较小的比例，远远无法满足临床和研究的需求。非分化性增殖，即在保持MSC的多向分化潜能和未分化状态的同时又能快速有效地增殖，成了目前急需解决的问题。

    1  间充质干细胞非分化性增殖的意义

    MSC可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞和内脏中胚层细胞等[1]。MSC在临床应用中的潜能巨大，譬如用于组织修复、免疫抑制细胞治疗和抗肿瘤基因治疗等[2]，近来，还有学者将其用于牵张成骨的研究[3]。然而，MSC在组织中的数量极其微小，例如在骨髓细胞中仅占0.001%～0.01%[4]，且在传代过程中其增殖能力逐渐减弱，并可能丧失其多向分化潜能。因此，寻求一种既能安全有效地促进MSC增殖，又能保持其在增殖过程中可塑性的培养方法是非常有意义的。

    2  间充质干细胞非分化性增殖存在的问题

    2.1  间充质干细胞增殖潜力的丧失

    研究证实，MSC在体外培养过程中会逐渐丧失其增殖潜力。由于端粒长的细胞其有丝分裂能力强于端粒短的细胞，随着细胞的不断分裂增殖，其端粒也逐渐缩短，表现为细胞的分子化衰老[5]；因此可用平均端粒限制性片段（mean elo-mere restrict fragment，mTRF）长度来推测MSC的剩余增殖能力。Baxter等[6]发现，在体外经过7～10次群体倍增后，MSC的mTRF长度缩短超过50%。这说明在现行的增殖培养过程中，细胞衰老不可避免。端粒酶是一种RNA依赖的DNA聚合酶，其作用在于保持端粒的长度，以调节和保持细胞的持续增殖能力。Zimmermann等[7]发现，与其他人类干细胞不同，MSC表现为端粒酶阴性，从而使其增殖能力不能无限制地发挥；Banfi等[8]发现，在MSC培养过程中几乎检测不到端粒酶的活性，且在增殖过程中端粒长度不断缩短，添加成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）-2也无济于事。

    2.2  间充质干细胞于增殖中丧失多向分化潜力

    近年来，有关MSC在增殖过程中逐渐丧失其多向分化潜力的报道越来越多。Banfi等[8]在MSC增殖培养过程中观察到逐渐增多的成骨特异性标志基因的表达，表明其多向分化潜力丧失，而且可能与培养基中添加了FGF-2有关。Bosnakovski 等[9]发现，牛MSC在冷凝培养基中可自发性地向软骨细胞分化。他们运用实时定量反转录聚合酶链反应来检测这一过程的蛋白表达，结果发现了大量软骨细胞特异蛋白的表达，如二聚糖、软骨低聚物基质蛋白、Ⅱ型和Ⅸ型胶原蛋白；同时还检测到大量成软骨细胞生长因子，如转化生长因子（transforming growth factor，TGF）、FGF、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-6和甲状旁腺素相关肽等。李志勇等[10]发现绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）转基因小鼠骨髓MSC能稳定表达GFP，可作为一个良好的示踪工具研究MSC的多向分化潜能。

    3  间充质干细胞非分化性增殖的方法

    3.1  用人血清或血浆代替胎牛血清

    胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）含有较高水平的生长刺激因子和较低水平的生长抑制因子，因此是目前MSC培养中应用最广泛的生长添加剂，但由此培养的MSC实际应用于临床时存在诸多隐患，如产生免疫反应和传输病毒等[11]。尽管有学者认为，人的血清或血浆并不能完全支持MSC的生长，但大量的研究证实，人血清或血浆在扩增MSC的同时保留了其多向分化的潜力。如在MSC培养液中加入新鲜冰冻血浆或富含血小板的血浆，均能显著加快MSC的增殖，提高集落形成效率并保持其分化为骨、软骨和脂肪的能力[12]。这说明人血清或血浆可能是一种安全有效的FBS替代品。最近有研究发现，经过人AB异种血清和凝血酶活化的富含血小板的血清对脂肪组织的MSC有显著的促增殖作用，而且能在长时间的培养过程中保持其分化潜力和表达干细胞标志物[13]。

    3.2  采用添加生长因子的无血清培养基

    尽管无（或低）血清培养基能够避免MSC的自发性分化，但若缺乏细胞因子或生长因子，单纯的无（或低）血清培养基却无法促进MSC的增殖，这可能缘于血清会诱导细胞内的钙离子震荡，而钙离子震荡对细胞的增殖和分化很重要。

    3.2.1  表皮生长因子  表皮生长因子受体（epider-mal growth factor ceptor，EGFR）包括HER-1、2、3和4，表达于MSC。Tamama等[14]发现，无（或低）血清培养基经EGF处理后能刺激人MSC增殖，20次群体倍增后约扩增6倍，此效应量与肝素结合性表皮生长因子（heparin-binding epider-mal growth factor，HB-EGF）基本相似。他们还发现，EGF可引发关键信号媒介的磷酸化，如细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated ki-nase，ERK）和蛋白激酶B，这些递质均被强烈激活，从而诱导细胞内的信号系统刺激MSC的增殖。同时，经EGF预处理后的MSC仍然能诱导分化为成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞，保持其多向分化潜能的特点。Krampera等[15]发现，HB-EGF/HER-1信号系统能促进MSC的有丝分裂并抑制其分化。在HB-EGF的作用下，MSC的增殖更快更持续，且这种促增殖作用相对于其他生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子（basic fibrob-last growth factor，bFGF）表现更为直接、长效且呈剂量依赖性，同时还依赖于HER-1的介导。HB-EGF在抑制MSC分化方面的作用较bFGF更强，不仅能抑制其自发性分化，而且使其在1～2周内能抵抗分化培养基的作用。

    3.2.2  血小板衍生生长因子  近年来，不少学者尝试在无血清培养基中添加血小板溶解物（plate-let lysis，PL），观察其能否代替传统的FBS以促进MSC体外增殖。Müller等[16]发现，尽管FBS培养基和添加PL的培养基所培养的MSC在形态和表型特征上无明显差异，但添加PL的培养基的促增殖和免疫抑制作用更加明显。Doucet等[17]同样在类似的研究中发现，PL富含血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、bFGF、TGF-β、胰岛素样生长因子（insulin-like growthfactor，IGF）-1等，可有效促进MSC的增殖并保持其多向分化和免疫抑制能力。Gruber等[18]发现，PDGF可激活ERK介导的信号传导并促进细胞的有丝分裂，但使用PDGF抑制剂PD98059只能抑制部分细胞活化效应，即可能还有其他的传导通路作用其中。此外他们还发现，PDGF能抑制MSC的骨向分化。Tamama等[14]也发现PDGF会抑制MSC的骨向分化和脂肪分化，从而证实了Gruber等[18]的研究结果。

    3.3  采用细胞外基质培养基

    3.3.1  基膜样细胞外基质  基膜样细胞外基质（basement membrane acellular matrix，bmECM）由PYS-2细胞或原代内皮细胞产生，主要成分为层粘连蛋白（laminin，LN）和Ⅳ型胶原蛋白，此外还有硫酸类肝素和巢蛋白。Matsubara等[19]采用bmECM涂层的培养皿来培养MSC，培养50 d后，其细胞总数较普通培养基多1×105倍，且在经过5次传代后，细胞形态没有明显的衰老变化；在MSC增殖至1×106倍时，仍可诱导分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。Tuan[20]发现，转染了端粒酶的MSC可保持其自我复制能力，但无法阻止骨分化能力的逐渐丧失。而Matsubara等[19]的研究证实，经bmECM培养的MSC在丧失复制能力后仍能保持其多向分化能力。他们还发现，单独用LN或Ⅳ型胶原蛋白涂层的培养皿，其促增殖效能不及bmECM。

    3.3.2  层粘连蛋白-5  LN-5是ECM蛋白分子家族成员之一，对细胞的黏附、增殖、分化和程序性细胞死亡有调节作用。Hashimoto等[21]将不同质量浓度的LN-5加入MSC生长培养基中发现，LN-5能剂量依赖性地促进MSC的增殖。然而在诱导骨分化的培养基中观察不到此种现象，提示LN-5的促增殖作用可能只发生于无分化趋向的MSC中。为了观察LN-5和其他生长因子能否产生联合效应，他们又在培养皿表面涂上一薄层LN-5，并在无血清培养基中添加bFGF，结果显示LN-5和bFGF能联合促进MSC的增殖，经LN-5培育后的MSC在相应诱导下能分化为软骨细胞或骨细胞，而LN-5的这种促增殖作用是通过整联蛋白α3β1和α6β1介导的。值得注意的是，LN-5也能抑制MSC向软骨细胞分化，即使同时添加相关诱导因子，同样对骨分化无明显影响。

    3.3.3  骨髓细胞来源的细胞外基质  Chen等[22]认为，MSC在体外培养时容易丧失干细胞特性，缘于离开了骨髓组织的特定微环境。因此，他们将鼠MSC培养在骨髓细胞来源的ECM中发现，这种ECM主要包含有Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原蛋白以及多配体聚糖-1、基膜蛋白多糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、二聚糖和核心蛋白多糖，类似于骨髓组织中的ECM成分。实验证实，这种培养环境可提高MSC的自我增殖能力且抑制其自发性分化，但其作用机制尚不明确。

    3.4  生物反应器的应用

    Colvin等[23]发现，微重力环境可促进干细胞增殖。旋转生物反应器可创建一种微重力和最小剪切应力的培养环境，即模拟体内的生长条件，特别适合于哺乳类动物细胞的生存。Chen等[22]将MSC置于旋转生物反应器内，采用干细胞造血长期液体培养液（MyeloCult）并添加白细胞介素-3和6培养8 d后，细胞总数，基质细胞抗原（stromal cell antigen，Stro）-1表达阳性、CD44表达阳性且CD34表达阴性的MSC 以及CD34表达阳性、CD44表达阳性且Stro-1表达阴性的HSC分别增加9、29和8倍。使用生物反应器的细胞，每天成纤维细胞集落形成率较不使用生物反应器者高1.44倍。增殖所得的MSC能表达内皮因子和弹性蛋白等原代MSC的标志物，未检测到与骨钙蛋白（成骨）、Ⅱ型胶原蛋白（成软骨）和CCAAT/增强子结合蛋白-α（成脂肪）等分化体系相关的标志物。同时，在成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞生长因子的诱导下，通过生物反应器增殖的MSC可分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。有实验推测，微重力的培养环境只能使干细胞的快速增殖维持较短的时间[21]。Chen等[24]发现大约8 d后细胞总数达到峰值，随后即开始下降，因此，第8天被认为是细胞在生物反应器中培养的平均天数。进一步的研究发现在静止的培养环境中，只有很小一部分的MSC参与了细胞的增殖周期（S+G2+M），80%的仍处于静止期（G0），而生物反应器却通过促进静止的前体细胞进入细胞周期，增加其增殖能力，进而缩短了集落形成所需的时间。

    3.5  添加中药成分

    研究发现，鹿茸、龟板和牛膝等中药提取物均能促进MSC的体外增殖，其中牛膝提取物最为引人注目。董群伟等[25]用甲噻唑四唑氮（MTT）检测牛膝含药血清对体外培养的MSC增殖作用的影响，检测碱性磷酸酶与骨钙蛋白以反映细胞分化的改变，反转录聚合酶链反应检测成骨相关转录因子的表达。结果MSC的增殖速度加快，无碱性磷酸酶和骨钙蛋白的表达，从而证实牛膝在体外有促进MSC增殖的作用且不影响其分化。

    综上所述，目前国内外已有关于MSC体外非分化性增殖的研究，但存在争议亦不少，其结果也无定论。因此，建立一套标准化的培养体系来实现MSC的大量增殖，从而建立间充质干细胞细胞系就显得十分必要。

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