口腔癌细胞诱导的淋巴管内皮细胞基因表达谱的变化

　　作者：张壮 张松涛 韩波 夏辉 潘剑    作者单位：1.口腔疾病研究国家重点实验室，四川大学；2.四川大学华西口腔医学院 口腔颌面外科教研室，四川 成都 610041

　　【摘要】  目的 探讨在口腔癌细胞影响下淋巴管内皮细胞分子表型的变化。方法 利用体外共培养模型，将淋巴管内皮细胞与口腔癌细胞进行共培养，模拟肿瘤中淋巴管内皮细胞的变化。应用Affymetrix U133 Plus 2.0基因芯片对肿瘤组织中淋巴管内皮细胞（TLEC）与淋巴管内皮细胞（LEC）基因表达的差异进行了检测和比较。并对功能相似的表达差异基因进行分类。结果 差异基因表达谱共发现了677个基因表达差异在1倍以上，其中在TLEC中表达上调的基因有384条，下调的基因有293条。这些基因与细胞黏附、凋亡、运动、发育及血管生成有关。同时这些基因还参与细胞的信号传导、免疫应答、细胞代谢等过程。结论 LEC与TLEC在分子水平是有差别的。以此为基础，可以针对淋巴管内皮细胞进行靶向阻断，达到治疗口腔癌淋巴道转移的目的。

　　【关键词】  口腔癌 淋巴管内皮细胞 淋巴道转移 基因芯片

　　Altered gene expression of lymphatic endothelial cells in oral cancer  ZHANG Zhuang1，2, ZHANG Song-tao2, HAN Bo2, XIA Hui2, PAN Jian2. （1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu 610041, China; 2. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery, West China College of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China）

　　[Abstract]  Objective  To explore altered molecular phenotype of lymphatic endothelial cells（LEC） induced byoral cancer cells. It is relevant to develop therapeutic strategies for blocking oral cancer spread through lymphatic vessels. Methods  LEC were co-cultured with oral cancer cells in a model. Differential gene expression profiles be-tween tumor-derived lymphatic endothelial cell（TLEC） and LEC were analyzed by Human Genome U133 Plus 2.0GeneChip arrays. Differential expression genes of functional similarity were classified. Results  Differential gene expression profiles revealed that 677 unique genes had at least a twofold change in expression level between the two groups, 384 were overexpressed，and 293 were underexpressed in TLEC. These genes were related to cell adhesion, apoptosis, cell motility, development, and angiogenesis. In addition, some genes were involved in signal transduction, immune response, cell metabolism, and so on. Conclusion  LEC and TLEC are distinct at the molecular level. A novel therapeutic strategy of lymphatic metastasis is encouraging and anticipated based upon manipulation of LECresponses to oral cancer cells.

　　 [Key words]  oral cancer； lymphatic endothelial cell； lymphatic metastasis； gene microarray

　　淋巴系统不仅在免疫监视、血浆－间质平衡、预防水肿、脂肪吸收等过程中起作用，而且在许多病理过程中起作用，包括肿瘤的淋巴道转移[1-2]。当肿瘤细胞与淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelialcell，LEC）接触之后，肿瘤细胞可以穿越内皮细胞屏障，进入淋巴管系统，进而发生转移。因此，LEC是发生转移癌细胞的重要作用界面，两者之间的相互作用是淋巴道播散的关键步骤。那么，口腔癌中的淋巴管内皮细胞与正常的淋巴管内皮细胞具有哪些差异，这些差异对口腔癌的淋巴道转移有何影响，目前很少报道。本实验利用人淋巴管内皮细胞与肿瘤细胞进行共培养，模拟了肿瘤组织中淋巴管内皮细胞（tumor-derived lymphatic endothelial cell，TLEC）的变化[3]，采用全基因组的芯片对正常LEC及肿瘤中LEC基因表达谱进行了检测和对比，从而更全面的了解LEC转录水平的变化。

　　1  材料和方法

　　1.1  细胞培养

　　人淋巴管内皮细胞（human lymphatic endothelialcells，HLEC）及内皮细胞培养基（endothelial cellmedium，ECM）均购自美国Sciencell研究实验室。完全内皮细胞培养基由500 mL ECM、25 mL FBS、5 mL内皮细胞生长添加剂（endothelial cell growthsupplement，ECGS）、5 mL青霉素/链霉素溶液组成。HLEC在37 ℃、5%CO2环境中进行常规培养传代。传代3次后用于后续实验。Tca8113细胞株为上海交通大学附属第九人民医院馈赠。应用添加5％FBS及5％双抗的RPMI 1640培养基（Gibco公司，美国）进行培养、传代。

　　1.2  Tca8113与LEC共培养模型的建立

    应用Transwell膜（Corning公司，美国）对共培养的细胞进行隔离。聚酯膜的孔径为0.4 μm。将Tca8113（每毫升1×106个）接种于聚酯膜过滤嵌套内，用添加5％FBS及5％双抗的RPMI 1640培养基培养，贴壁后PBS洗2次。将附着细胞的嵌套转入6孔板中，其中的LEC已经汇合。加入无ECGS的ECM，于37 ℃、5%CO2环境中共培养3~5 d，观察共培养后LEC细胞形态学改变。

　　1.3  肿瘤细胞总RNA的提取和纯化

　　吸去培养液，4 ℃预冷DEPC-PBS溶液冲洗1次。加入Trizol（Invitrigen公司，美国）振荡并以移液器反复吹打。氯仿振荡混匀，室温放置2~3 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，吸取上层水相至DEPC预处理的EP管中。加入0.5 mL异丙醇，-20 ℃沉淀30 min。4 ℃下12 000 r/min离心10 min，弃上清。沉淀中加入1 mL 75%乙醇，于4 ℃下12 000 r/min离心10 min，小心移出上清。重复用75%乙醇洗涤RNA沉淀。加入30 μL无RNase水，充分溶解。变性凝胶电泳进行质检。参照说明书，应用Rneasy Mini Kit（Qiagen 公司，美国）对总RNA进行纯化，琼脂糖凝胶电泳进行质检。

　　1.4  cDNA和cRNA的制备

　　应用Affymetrix one-cycle cDNA Synthesis Kit （Affymetrix公司，美国）将总RNA分别合成1st cDNA及2nd cDNA。合成的cDNA应用Affymetrix GeneChip Sample Cleanup Module（Affymetrix公司，美国）进行纯化。纯化后的产物采用GeneChip IVT Labeling Kit（Affymetrix公司，美国）反转录成cRNA。cRNA再次经过GeneChip Sample Cleanup Module进行纯化cRNA。加入片段化缓冲液及无RNase水，配置缓冲体系，94 ℃温浴35 min，之后置于冰上。片段化cRNA约为35~200 bp，配置杂交液，待芯片检测。

　　1.5  芯片杂交、洗脱和扫描

　　实验采用Human Genome U133 Plus 2.0 Gene-Chip arrays（Affymetrix公司，美国），芯片包含47 000转录本，代表38 500明确的基因。首先在AffymetrixHybridization Oven 640（Affymetrix公司， 美国）中进行测试芯片的杂交、洗染和分析，根据测试芯片的结果，检测合格后再杂交表达谱芯片。应用GeneArrayTM scanner 3000（Affymetrix公司，美国）扫描芯片获得原始数据。判断Affymetrix基因芯片实验成功的标准如下：基因芯片的扫描图像外观必须出现4条明暗交替模式、拐角棋盘模式；左上角芯片名称清晰；芯片中央有十字模式。背景平均值为20~150。lys、phe、thr、dap信号值应呈现递增的趋势；杂交对照bioC、bioD、cre应该总是检测到, 并且以递增的信号强度表达。β-Actin和GAPDH探针组的3′/5′比值至少小于3；总体基因的表达率不能低于20％。

　　1.6  数据分析

　　扫描后获得的图像应用GCOS软件进行数据分析。图像中的荧光强度去除背景干扰，Normalization进行定量。探针信号表达强度上调1倍或者对照样本中表达缺失的基因认为是表达上调基因。反之亦然，认为是表达下调的基因。对于表达差异的基因应用unsupervised hierarchical cluster分析，将功能相似的基因进行分组归类。

　　2  结果

　　2.1  LEC及TLEC的形态学观察倒置显微镜下观察，LEC与TLEC都表现为典型的内皮细胞形态，汇合后形成“砌路石”外观（图1A、1D）。在包被纤维粘连蛋白的孔板中，都可以形成管型结构。通过形态学观察，两者之间没有明显的区别。Tca8113细胞能够在体外顺利扩增，呈上皮细胞形态，分化程度低（图1B）。接种于Transwell膜后，细胞能够良好贴壁（图1C）。本次共培养采用的膜能够良好的分离肿瘤与淋巴管内皮细胞，培养过程中未见到两种细胞的混合。

　　2.2  RNA质检

　　本实验收集LEC及TLEC各一份标本，分别将提取的总RNA进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果可见明显的28 S、18 S这2条带，清晰，无明显脱尾。5 S区带不明显。说明RNA提取质量较高，无明显降解。

　　2.3  Affymetrix基因芯片实验质量控制

　　根据Affymetrix基因芯片的技术特点，无论是测试芯片还是实验芯片，基因芯片的样本是高质量的，实验操作是成功的，得出的结果是可信的。

　　2.4  TLEC与LEC差异性表达基因

　　根据扫描后基因芯片的信号强度对TLEC及LEC的差异表达进行了分析。表达升高或降低1倍以上的基因认为是差异表达基因。本实验中共发现677个差异基因，其中384个基因表达上调，293个基因表达下调。这些基因与细胞黏附、凋亡、运动、发育及血管生成有关。同时这些基因还参与细胞的信号传导、免疫应答、细胞代谢等过程（部分差异基因见表1、2）。

　　3  讨论

　　淋巴系统是肿瘤扩散的一个重要通道，尤其对口腔癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）来说，淋巴道转移具有更重要的意义[4]。因为OSCC容易发生早期的淋巴道转移，同时颈部淋巴结是否发生转移是癌症患者生存及预后的重要影响因素[5-6]。近来发现的促进淋巴管生成的因子以及淋巴管内皮细胞的标志物，使研究淋巴道转移过程中肿瘤细胞与LEC的相互作用成为可能。在此基础上，如何通过阻断LEC与肿瘤细胞的相互作用进而减少淋巴道转移几率成为肿瘤转移领域的热点，因为这是一种全新的治疗策略，不仅是从肿瘤细胞自身的角度，而且从淋巴道转移的关键及限速步骤入手，着眼于肿瘤细胞与微环境中转移相关的关键因素淋巴管内皮细胞[7-8]。

　　多项研究[9-14]表明，OSCC中同样存在淋巴管生成的现象。一般将OSCC中的淋巴管分成2种：癌周淋巴管（peritumor lymphatics，PTLs）和癌中淋巴管（intratumor lymphatics，ITLs）。肿瘤细胞很可能主要通过PTLs发生淋巴道转移，但是不能排除ITLs参与转移的可能[15-16]。但是，肿瘤细胞成功实现转移除了管腔数量及面积的多少，更主要取决于肿瘤细胞能否向LEC移动、黏附及穿越内皮细胞屏障。那么，在发生淋巴道转移的肿瘤中，LEC表达哪些参与肿瘤细胞趋化或是黏附等过程的分子呢？肿瘤中LEC基因表型与正常组织中LEC有什么区别，与肿瘤的淋巴道转移有什么联系呢？目前对这些问题知之甚少。但是从相关的肿瘤组织内血管内皮细胞研究文献可以推测：TLEC可能与肿瘤组织内血管内皮细胞相似，形成与正常LEC不同的特殊表型，甚至表达一些组织特异或者肿瘤特异性的分子[17-18]。

　　为了揭示TLEC基因表型的变化，本实验利用LEC与Tca8113进行共培养，模拟LEC的肿瘤环境。此外，为了更全面的了解TLEC与LEC基因表达的差异，采用全基因组芯片，对细胞表达的所有基因进行转录水平的分析。结果显示：相对于LEC，TLEC中大约有677个明确的基因表达上调或是下调1倍以上，并且这些基因具有特定的功能，与细胞的凋亡、生长、黏附以及细胞外基质的构成有关。因此实验结果提供了明确的TLEC的分子特征，为进一步研究LEC在淋巴道转移过程中的作用提供了基础。同时，从中也可以得到几个重要的结论：首先TLEC与LEC是高度相似的，因为通过全基因组的扫描，只发现了677个差异基因；其次，TLEC与LEC在性质上又是完全不同的，384个上调的基因和293个下调的基因已经造成了LEC生物学性状的改变；另外，TLEC已经具有了特定的分子表型，可能主动参与淋巴道转移的过程。例如，多个参与血管生成的生长因子在TLEC表达上调；3种细胞生长因子及细胞因子表达上调，仅有一种表达下调；参与细胞外基质构成的分子发生了显著的改变。这些分子已经证明与淋巴道转移关系密切。

　　肿瘤转移的机制目前不明，但是有一点可以肯定，肿瘤转移不是一个随机的过程。肿瘤细胞可能通过主动或是被动的方式进入管道系统[19]，比较认可的解释是一方面肿瘤细胞沿着趋化分子形成的梯度进行迁移，一方面内皮细胞表达的组织特异性黏附分子选择迁移的肿瘤细胞并指导定向转移[20-21]。本实验结果显示，TLEC可以表达生长因子、细胞因子、趋化因子及与细胞黏附相关的分子，说明TLEC不仅可以参与迁移梯度的形成，而且可以参与肿瘤细胞的定向转移，在淋巴道转移过程中发挥主动的作用。因此，在淋巴道转移过程中，TLEC可能不是传统观点认为的一个被动参与因素[22-23]。

　　总之，在本实验中发现了TLEC中600余个差异表达的基因，虽然数目不多，但是如何确定参与淋巴道转移的相关基因还是相当困难。不仅仅是因为差异基因数目较多，主要是这些基因的功能还没有完全清楚。但是，深入理解正常组织及肿瘤组织中LEC基因表达差异的意义，对于发现参与淋巴道转移的相关基因具有重要意义。本研究为阻断肿瘤细胞与LEC相互作用提供了理论基础，为今后淋巴道转移靶向治疗提供了新的思路。

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