T细胞免疫和细胞凋亡在口腔扁平苔藓发病中的作用
发表时间：2009-08-13 浏览次数：609次
作者：邓冠红 陈作良 陈宏柏 程筠 作者单位：福建医科大学口腔教学医院·厦门市口腔医院 口腔黏膜病科，福建 厦门 361003
【摘要】目的 通过探讨口腔扁平苔藓（OLP）中细胞凋亡情况及CD4＋、CD8＋T细胞和CD4/CD8比例的变化分析细胞免疫与细胞凋亡的关系，进一步了解OLP的发病机制。方法 应用免疫组化SP法检测27例OLP组织中CD4＋、CD8＋T细胞的表达水平，并用原位末端转移酶标记法（TUNEL）定位检测17例OLP中细胞凋亡情况。结果 OLP组固有层中CD4＋、CD8＋T细胞明显高于对照组（P＜0.05），CD4/CD8值降低。OLP组中上皮内细胞凋亡指数高于对照组，固有层淋巴细胞凋亡指数明显低于对照组。结论 OLP组固有层中CD4＋、CD8＋T细胞浸润的增加、CD4/CD8比值的变化及OLP中上皮细胞和固有层淋巴细胞凋亡异常，说明细胞免疫功能紊乱和细胞凋亡异常在OLP发病中起重要作用。
【关键词】 口腔扁平苔藓 细胞凋亡 CD4＋T细胞 CD8＋T细胞
Significance of cell immunoreactions and cell apoptosis in oral lichen planus DENG Guan-hong, CHEN Zuo-liang, CHEN Hong-bai，CHENG Jun. （Dept. of Oral Medicine, Xiamen Stomatology Hospital，Xiamen 361003, China）
[Abstract] Objective To evaluate the expression of CD4+, CD8+T cells and cell apoptosis in oral lichen planus（OLP） and investigate the role and the relationship of immunological reaction and cell apoptosis in the pathogenesis of OLP. Methods Immunohistochemical technique was used to study the expression of CD4+, CD8+T cells in 27 OLP cases. TUNEL was used for detecting the cell apoptotic index（AI） in 17 OLP cases. Results The expression ofCD4+, CD8+T cells were obviously elevated in lamina propria of OLP group compared with control group（P＜0.05）.There was a strong significance when compared the ration of CD4/CD8 in both group. AI was remarkably increased in epithelia cells and significantly decreased in lymphocytes in lamina propria in OLP cases compared with its expression in the control group respectively. Conclusion The increased amount of CD4+, CD8+T cells in lamina propria of OLP and the change ration of CD4/CD8 suggest that immune response is involved in the pathogenesis of OLP. The abnormal cell apoptosis plays an important role in the pathogenesis of OLP.
[Key words] oral lichen planus； apoptosis； CD4+T cells； CD8+T cells
口腔扁平苔藓（oral lichen planus，OLP）是一种常见的病因不明的慢性非传染性的口腔黏膜炎症性疾病。其主要的病理改变是基底细胞液化变性及上皮下淋巴细胞浸润。本研究通过免疫组化法检测OLP中CD4＋、CD8＋T的表达情况，用原位末端转移酶标记法（TUNEL）标记凋亡细胞，探讨细胞免疫和细胞凋亡在OLP发病中的作用。
1 材料和方法
1.1 标本的收集
本实验27例标本来源于福建医科大学口腔教学医院·厦门市口腔医院口腔黏膜病科门诊就诊的OLP患者，男12例，女15例。均无系统性疾病及免疫性疾病，为初诊患者，未接受过治疗。其中非糜烂型（包括网状型、条纹型、斑块型及丘疹型等）14例，糜烂型（包括红斑型、萎缩型）13例。病例经临床和病理上确诊为OLP（诊断标准参考文献[1]）。另取10例健康成人的正常口腔黏膜作为对照组，经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色证明无黏膜疾患。所有研究对象均签署了知情同意书。
1.2 试剂
原位凋亡检测试剂盒（瑞士罗氏生物制品有限公司），CD4、CD8抗体（Labvision公司，美国）。
1.3 方法
所有标本经10％甲醛固定，常规石蜡包埋备用。将标本用石蜡包埋，连续切片厚度为4 μm，免疫组化SP法检测27例OLP组织中CD4＋、CD8＋T的表达情况；随机选取17例OLP和5例正常黏膜用TUNEL法进行细胞凋亡检测。
1.3.1 免疫组化法检测CD4＋、CD8＋T细胞 将组织切片依次脱蜡至水后，在切片上滴加3％过氧化氢10 min，PBS洗片；加入50 μL过氧化物酶阻断液，室温孵育10 min，PBS洗片；加入50 μL非免疫动物血清，室温孵育10 min，PBS洗片；分别加入一抗（CD4＋、CD8＋）湿盒中4 ℃过夜，PBS洗片；加二抗室温孵育30 min，PBS洗片；加入SP室温孵育10 min，PBS洗片；用新配制的DAB复合液显色，苏木素复染，脱水，封固，其中抗体滴度为1∶100。阳性对照采用美国Labvision公司提供的阳性对照片，以非免疫动物血清代替一抗作为替代对照，空白对照用PBS代替一抗。在细胞浆中，染色呈黄褐色颗粒者为CD4＋、CD8＋T细胞阳性。在OLP病变典型区对固有层CD4、CD8单克隆抗体免疫组化染色胞浆呈黄褐色的细胞进行计数，随意计数6个高倍视野（×400），计算每个高倍视野阳性细胞的平均数。
1.3.2 原位末端转移酶标记法检测细胞凋亡 将组织切片依次脱蜡至水，加入胃蛋白酶K于室温水解30 min，洗片；加入2％过氧化氢于室温反应5 min，洗片；加入TdT酶缓冲液置室温5 min；加入TdT反应液置湿盒于37 ℃反应1 h；加入终止缓冲液37 ℃保温30 min，洗片；加入碱性磷酸酶抗体置于湿盒中37 ℃反应30 min，洗片；用新配制的NBT液染色10 min，洗片；核快红室温复染10 min，洗片，脱水，封固。用PBS代替TdT酶反应液作为空白对照。光镜下细胞核染蓝黑色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。在病变典型处连续计数5个高倍视野（×400），计数500个以上细胞中阳性细胞所占的百分比，即凋亡指数（apoptotic index，AI）。
1.4 统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件对数据进行分析，组间采用单因素方差分析LSD－t检验进行统计分析，两变量间相关关系（固有层内T细胞与淋巴细胞凋亡的关系及T细胞与OLP病程的关系）用直线相关分析，计算Pearson相关系数（r）。
2 结果
2.1 CD4+、CD8+T细胞染色结果及CD4/CD8比例变化对照组上皮内几乎不表达CD4＋、CD8＋T细胞，固有层内少量CD4＋、CD8＋T细胞表达；OLP组CD8＋T细胞主要表达于接近基底膜破坏处的固有层浅层，CD4＋T细胞主要表达于固有层深层（图1）。对照组、OLP组中CD4＋、CD8＋T细胞数及CD4/CD8见表1。OLP组固有层CD4＋、CD8＋T细胞数明显高于对照组（P＜0.05）。CD4/CD8比值下降，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。OLP组糜烂型中CD4＋、CD8＋T细胞数与非糜烂型相比差异均无统计学意义。
2.2 细胞凋亡情况
在OLP上皮及固有层均可见凋亡细胞，核呈蓝黑色，轮廓清楚、致密（图2、3）。OLP上皮中凋亡细胞多位于基底层或基底上层，且多发生于基底细胞液化变性处，而对照组中凋亡细胞多位于棘层（图2）。OLP固有层的细胞凋亡多远离固有层细胞浸润带，而对照组细胞凋亡多位于细胞浸润带（图3）。OLP组与对照组中细胞凋亡指数的检测结果见表2。OLP组固有层的细胞凋亡指数明显低于对照组（P＜0.05）。OLP组中上皮细胞的凋亡指数明显高于对照组（P＜0.05）。
2.3 CD8＋T细胞与细胞凋亡及病程的相关关系
用直线相关分析对OLP中固有层内浸润的CD8＋T细胞表达与固有层内淋巴细胞凋亡及与病程的相关性进行分析，其Pearson相关系数分别为－0.674、0.553，P均小于0.05。实验结果表明OLP中固有层内CD8＋T细胞的表达与固有层内淋巴细胞凋亡呈负相关，CD8＋T细胞的表达与病程呈正相关（图4、5）。
3 讨论
OLP是T细胞介导的炎症疾病，与自身免疫功能有关，各种致病因素导致上皮角质细胞抗原性发生改变，这种改变的抗原被朗格罕斯细胞等所摄取，并提呈给CD4＋T细胞，这些细胞释放并激活各种细胞因子破坏上皮，同时这些细胞因子激活CD8＋T细胞启动一系列免疫反应，导致OLP病损的形成[2]。研究发现OLP中炎症浸润的大部分细胞为CD4＋、CD8＋T细胞，且CD4/CD8比值下降[3]。Khan等[4]也发现上皮内、上皮下浅表固有层大多数淋巴细胞为CD8＋T细胞，且CD8＋T细胞与凋亡的角质细胞相邻。本研究显示OLP中上皮内及上皮下浅表固有层浸润细胞多为CD8＋T细胞。对OLP固有层内CD8＋T细胞表达数量与病程进行相关性分析，发现与病程呈正相关。固有层深层内浸润细胞多为CD4＋T细胞，且CD4/CD8比值比对照组明显降低（P＜0.05）。这提示OLP中存在T细胞亚群平衡失调和T淋巴细胞功能紊乱。T淋巴细胞介导的免疫反应在OLP发生、发展中起重要作用。研究认为凋亡是OLP中细胞死亡的重要机制[5]。有关OLP中上皮细胞的凋亡情况，国内外研究者持有不同意见。研究显示OLP中野生型P53蛋白在上皮细胞表达升高，说明其上皮细胞凋亡增强[6]。研究发现，对比正常口腔黏膜，OLP上皮凋亡细胞数增加[7-8]。而周威等[9]研究认为OLP中上皮细胞的凋亡是减少的。还有学者发现OLP中同时存在角质细胞凋亡增加及淋巴细胞凋亡减少[10]。本研究发现OLP中上皮细胞凋亡明显增加，与对照组相比，差异有统计学意义。其中凋亡的细胞多局限分布在基底层及基底上层细胞，且在基底细胞液化较明显处上皮内出现较多的凋亡细胞，其分布与以往报道一致[11-12]。本研究还发现凋亡细胞与临床类型无关，糜烂型与非糜烂型无差异。OLP上皮细胞凋亡增加多局限于基底层，细胞凋亡与细胞液化变性的分布相一致。这说明OLP中上皮细胞凋亡增加与本病的发生有关。实验结果也发现OLP上皮内凋亡的细胞与浸润的T细胞相毗邻，对固有层内浸润的CD8＋T细胞的表达与固有层淋巴细胞凋亡相关性进行分析，发现CD8＋T细胞的表达与OLP中固有层淋巴细胞凋亡指数呈负相关关系。因此推测：1）OLP中T淋巴细胞聚集可能受到了上皮细胞的某些抗原性改变所趋化；2）CD8+T细胞增加与上皮基底细胞凋亡有关系；3）T淋巴细胞凋亡减少与本病的发生、发展、慢性迁延有内在联系；4）基底细胞液化变性和上皮细胞凋亡的增加可能受到了CD8+T细胞的攻击和诱导。因此基底细胞液化变性与T细胞的浸润和细胞凋亡异常有关，但二者之间哪个是初发损害还有待进一步研究。
【参考文献】[1] 李秉琦. 口腔粘膜病学[M]. 2版. 北京： 人民卫生出版社, 2003： 83-87. LI Bing-qi. Diseases of the oral mucosa[M]. 2nd ed. Beijing： People′s Health Publishing House, 2003：83-87.
[2] Femiano F, Cozzolino F, Gaeta GM, et al. Recent advances on the pathogenesis of oral lichen planus（OLP）. The adhesion mo- lecules[J]. Minerva Stomatol, 1999, 48（4）：151-159.
[3] Villarroel Dorrego M, Correnti M, Delgado R, et al. Oral lichen planus： Immunohistology of mucosal lesions[J]. J Oral Pathol Med, 2002, 31（7）：410-414.
[4] Khan A, Farah CS, Savage NW, et al. Th1 cytokines in oral lichen planus[J]. J Oral Pathol Med, 2003, 32（2）：77-83.
[5] 刘青, 金岩, 吴织芬. 肿瘤坏死因子α与口腔扁平苔藓[J]. 牙体 牙髓牙周病学杂志, 2000, 10（10）：242-244. LIU Qing, JIN Yan, WU Zhi-fen. Expression of TNF-α in oral lichen planus[J]. Chin J Conserv Dent, 2000, 10（10）：242- 244.
[6] Dekker NP, Lozada-Nur F, Lagenaur LA, et al. Apoptosis-as- sociated markers in oral lichen planus[J]. J Oral Pathol Med, 1997, 26（4）：170-175.
[7] Hirota M, Ito T, Okudela K, et al. Cell proliferation activity and the expression of cell cycle regulatory proteins in oral lichen planus[J]. J Oral Pathol Med, 2002, 31（4）：204-212.
[8] Neppelberg E, Johannessen AC, Jonsson R. Apoptosis in oral lichen planus[J]. Eur J Oral Sci, 2001, 109（5）：361-364.
[9] 周威, 金岩, 吴织芬, 等. 口腔扁平苔藓上皮细胞凋亡状况的分 析和意义[J]. 牙体牙髓牙周病学杂志, 2001, 11（5）：321-323. ZHOU Wei, JIN Yan, WU Zhi-fen, et al. The alteration of apo- ptosis in oral lichen planus[J]. Chin J Conserv Dent, 2001, 11 （5）：321-323.
[10] 沈丽佳, 阮萍, 谢方方, 等. Fas/FasL和颗粒酶B在口腔扁平苔藓 中的表达及意义[J]. 第一军医大学学报, 2004, 24（12）：1362- 1366. SHEN Li-jia, RUAN Ping, XIE Fang-fang, et al. Expression of Fas/FasL and granzyme B in oral lichen planus and their sig- nificance[J]. First Mil Med Univ, 2004, 24（12）：1362-1366.
[11] Tanda N, Mori S, Saito K, et al. Expression of apoptotic signal- ing proteins in leukoplakia and oral lichen planus： Quantitative and topographical studies[J]. J Oral Pathol Med, 2000, 29（8）： 385-393.
[12] Majorana A, Facchetti F, Pellegrini W, et al. Apoptosis-associ- ated markers in oral lichen planus[J]. J Oral Pathol Med, 1999, 28（1）：47-48.
