rhBMP2缓释微球对牙龈成纤维细胞的生物学作用

作者：陈发明　吴织芬　金岩　王勤涛　姜玲　杜岩　王国芳

　　［摘要］  目的：观察甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（dex-GMA）载重组人骨形态发生蛋白-2 (rhBMP2)缓释微球（MPs）对体外培养的人牙龈成纤维细胞（GFCs）的生物学作用。方法：采用体外细胞培养技术，将rhBMP2缓释微球和GFCs一起培养，采用MTT法检测其对GFCs的增殖状况的影响；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒检测细胞ALP活性以反映rhBMP2缓释微球对其分化状况的影响，并与单纯rhBMP2的作用进行比较。结果：rhBMP2缓释微球具有良好的生物学活性，能显著促进的GFCs增殖及分化，并维持10 d以上，其效应高于单纯施加rhBMP2的效应。结论：所制备的rhBMP2微球比单纯rhBMP2对GFCs有更为明显的生物学效应，可以达到对生长因子的有效缓释。

　　［关键词］  骨形态发生蛋白类  微球体  缓释  牙龈成纤维细胞

　　Biological Effects of Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2 Loaded Dextran-based Microspheres on Gingival Fibroblast Cells in Vitro.

　　CHEN Fa-ming, WU Zhi-fen, JIN Yan, et al.

　　Department of Periodontology and Mucosal Diseases, College of Stomatology, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032

　　［Abjective］Objective: To evaluate the biological effects of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP2) loaded dextran-based  microspheres (rhBMP2-dex-MPs) on cultured gingival fibroblast cells (GFCs) in vitro. Methods: Cell culture technique and MTT colorimetric assay were used to evaluate the proliferation of the GFCs,  ALP kit was used to evaluate the ALP activity of the GFCs so as to show the differentiation of the cells by adding the rhBMP2-dex-MPs or rhBMP2 only. Results: The results showed that rhBMP2-dex-MPs had biological activity, and statistical analysis showed that rhBMP2-dex-MPs could enhance significantly both proliferation and differentiation of human GFCs more than 10 days, the effect of the rhBMP2-dex-MPs was significantly higher than that of rhBMP2. Conclusion: The biological effects of  rhBMP2-dex-MPs were  significantly higher on cultured cells than　that of  rhBMP2 only. Encapsulating rhBMP2  into dex-MPs　may be an effective way of  rhBMP2 sustained release in tissue engineering work.

　　［Key words］  Bone morphogenetic proteins  Microspheres  Sustained release  Gingival fibroblast cells

    重组人骨形态发生蛋白2 (recombinant human bone morphogenetic protein-2， rhBMP2)直接使用在体内会很快失活，因此近年来不断有报道利用不同的缓释载体携带rhBMP2等外源性生长因子促进组织再生或应用于组织工程，均取得了较好的效果［1，2］。最近国外有人通过改变明胶微球的溶涨系数，甚至可以达到生长因子的控制释放［3，4］。我们在前面的实验中设计合成了甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（dextran-glycidyl methacrylate, dex-GMA），并以此为材料，制备出含活性rhBMP2的dex-GMA缓释微球（rhBMP2-dex-MPs），体外释药试验证实了其对rhBMP2确切的缓释效果。牙龈成纤维细胞（gingival fibroblast cells, GFCs）来源广泛，容易获得，是牙周组织工程的重要种子细胞［5］。本研究旨在观察rhBMP2-dex-MPs对体外培养的人GFCs的生物学作用，从而为其在牙周组织工程领域的进一步应用提供依据。

　　1  材料与方法

1.1  主要材料、试剂、设备  甲基丙烯酸缩水甘油酯右旋糖酐（dex-GMA，作者合成）； rhBMP2(军事医学科学院)；DEME培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(FBS，北京军区兽医防治中心)；胰蛋白酶(美国Sigma公司)；噻唑兰(MTT，北京天象人生物制品公司)；二甲基亚砜(DMSO，天津白世化学制品公司)；ALP检测试剂盒(南京建成生物技术公司)；Triton X-100 (华美公司)。恒温振荡器(TH 2-82型，上海跃进医疗器械厂)；真空干燥箱(大连第四仪表厂)；医用离心机 (北京仪器厂)； DG-5013型酶联免疫检测仪（华东电子管厂）； CO2孵箱（美国Sheldon Manufacturing公司）。

　　1.2  人GFCs的培养  将因导萌术或埋藏阻生齿拔除时切取的健康牙龈组织，在超净台内剪碎，以酶消化法（Ⅰ型胶原酶）获得体外生长的人GFCs。细胞游出后每3 d 换液一次，待细胞长满瓶底，进行传代培养。实验前用波形丝蛋白和角蛋白抗体染色，鉴定细胞起源，收集第4代细胞进行实验。

　　1.3  实验方法

　　1.3.1  实验分组  细胞经消化后计数，用培养液调整浓度至0.5×104个细胞/mL，加入96孔板，每孔100 μL（相当于500个细胞）。24 h后换成含1% FBS的DMEM培养液，并按组别分别加入以下不同物质：A组加入浓度200 μg/L的单纯rhBMP2、B组加入含等量rhBMP2的rhBMP2-dex-MPs、C组加入不含rhBMP2的空白dex-MPs、D组空白对照，每浓度每时间点设3个孔，分别在培养1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、10 d和12 d后进行检测。

　　1.3.2  MTT比色法  分别在培养后相应时间点，加入5% MTT 20 μL，4 h后吸去孔内液体，再加入150 μL DMSO，振荡10 min后酶联检测仪490 nm波长测光吸收值以反映其对细胞增殖的影响。

　　1.3.3  ALP检测  亦在相同时间点弃去培养液，加入0.2% Triton X-10 050μL，按试剂盒要求先后加入缓冲液、基质液各50 μL，显色剂150 μL，分光光度计520 nm波长测OD值以反映其对细胞分化的影响。

　　1.3.4  统计学分析  结果以均数±标准差(±s)表示，两组均数间的比较采用t检验，多组均数间的比较采用单向方差分析(One-way  ANOVA)。

　　2  结果

　　2.1  细胞生长情况  GFCs在正常培养条件下，可稳定生长10代以上，细胞增殖较活跃，形态良好；加入rhBMP2或rhBMP2-dex-MPs后细胞增殖明显加快，培养5~7 d后，C、D组均有细胞衰老、死亡，而A、B组相对较少；B组细胞10 d后生长状态明显优于其它组，表明rhBMP2-dex-MPs持续释放的rhBMP2有延缓GFCs衰老的作用。

　　2.2  MTT实验结果  rhBMP2和rhBMP2-dex-MPs对人GFCs的增殖都有明显的促进作用，在培养初期没有显著差异（P>0.05），但rhBMP2-dex-MPs促增殖作用的时间效应明显延长，可以持续到12天左右，见表1、图1。

　　表1  rhBMP2及rhBMP2-dex-MPs对GFCs增殖的作用　略

　　表2  rhBMP2及rhBMP2-dex-MPs对GFCs  ALP活性的影响　略

　　2.3  GFCs的ALP活性  GFCs的ALP活性测量结果见表2、图2。由图2可见，A、B组GFCs增殖分化速度在全过程中均明显快于C、D组(P<0.05)，说明rhBMP2可以明显提高GFCs的生物学活性，在促进细胞的增殖分化和组织再生中起着重要的作用。A、B组在3d内细胞的增殖和分化速度无显著性差异(P>0.05)，表明rhBMP2-dex-MPs中的rhBMP2具有良好的活性，没有在微球的制备过程中失活；5 d后，B组较A组增殖和分化明显加快(P<0.01)，并持续到12天左右，说明rhBMP2-dex-MPs对生长因子有确切的缓释作用。12 d后B组细胞爬满孔壁，部分细胞由于相互抑制开始死亡，因此没能进一步观察rhBMP2-dex-MPs对rhBMP2的缓释效果。

　　图1  不同时间点GFCs生长曲线　略

   　图2  不同时间点GFCs的ALP活性　略

　　3  讨论

    牙周组织的修复再生是一个多因素调控的过程，其中PDLCs的作用至关重要，它们包括有不同功能的成熟细胞和具有分化潜力的未分化细胞，后者也称为前体细胞，是新生细胞的来源，可分化为成熟细胞：成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞等，有利于牙周组织的再生和新骨、牙骨质的形成［6］。此外，牙周膜细胞能合成和分泌大量胶原物质，其有利于牙周再生。研究表明多种生长因子对PDLCs增殖分化和细胞外基质合成有促进作用，能显著促进PDLCs的生物学活性［7，8］。然而PDLCs作为种子细胞具有一定的局限性，它来源有限，须拔除一定量自体牙才能获得，难以在临床上广泛开展。GFCs作为牙周组织的重要组成成分，来源丰富、容易获得、具有很强的生长和自我繁殖能力，在适当的刺激下，可表达成骨细胞表型,因此在牙周组织工程研究中，研究GFCs的增殖、分化和成骨，比PDLCs更有应用前景［8］。评价一种材料、药物或是生长因子对牙周组织再生与修复的促进作用，观察其对GFCs和PDLCs生物活性的促进作用是目前大多数研究所公认的方法［9］。本实验结果表明我们设计研制的rhBMP2-dex-MPs具有良好的生物学活性，可以达到rhBMP2的缓慢释放，有望进一步推广应用。

    牙周组织再生能力极其有限，是牙周病的治疗和牙周缺损修复临床疗效差的主要原因。一些相应的辅助治疗方法虽然给临床治疗带来新的希望，但远没有达到理想的目标。牙周组织工程有望解决这个难题［10，11］。广义牙周组织工程学同样包括生长因子/支架材料、种子细胞/支架材料和种子细胞/生长因子/支架材料3种构建方式，由于后两种构建方式离临床应用还有许多问题（如种子细胞的来源、免疫原性等）不能解决，因此在牙周组织工程中，利用合适的载体材料携带外源性生长因子促进牙周组织再生报道较多［10］，本研究是利用天然材料合成外源性生长因子缓释载体的一种尝试。

    载体及缓释系统起到了载负生长因子使之与周围组织均匀接触、利于诱导周围细胞的增殖分化、可作为骨生长支架促进骨生长三重作用［1］。有报道以胶原作为支架，携带bFGF明胶微球修复犬的人工牙槽骨缺损；Holland等［3，4］已经成功将TGF-β的缓释延长到3~4周，将药物控释技术引入促进牙周组织修复再生，具有重要的临床意义［10，12］。我们制备的rhBMP2-dex-MPs，既可以复合骨支架材料修复骨缺损，又可以制备引导组织再生生物膜应用于牙周缺损的修复治疗，是一种具有广阔应用前景的控释系统。本研究中细胞连续培养12 d， C、D组细胞有大量细胞死亡，这可能会对实验结果造成一定的影响，因此rhBMP2-dex-MPs的细胞学研究还有待深入。同时我们实验中发现A、B组细胞死亡明显减少，这说明rhBMP2有延缓GFCs衰老的作用，特别是B组细胞12 d后仍然生长良好，这可能是rhBMP2-dex-MPs对rhBMP2缓释的结果。

　　参考文献

　　［1］  陈发明，吴织芬，金岩.生长因子载体及缓释系统的研究进展［J］.国外医学口腔医学分册，2005,32(1)∶44-46

　　［2］  段宏，王光林，裴福兴，等.碱性成纤维细胞生长因子缓释微球对成骨细胞作用的实验研究［J］.中华创伤杂志，2004 ，20 (1) ∶89-92

　　［3］  Holland TA, Tabata Y, Mikos AG. In vitro release of transforming growth factor-beta1 from gelatin microparticles encapsulated in biodegradable, injectable oligo(poly (ethylene glycol)  fumarate) hydrogels ［J］. J Control Release，2003,91（3）∶299-313

　　［4］  Holland TA, Tessmar JK, Tabata Y, et al. Transforming growth factor-beta1 release from oligo［poly(ethylene glycol) fumarate］ hydrogels in conditions that model the cartilage wound healing environment ［J］. J Control Release, 2004 ,94（1）∶101-114

   　［5］  徐燕，李颂，程继光，等.人牙龈成纤维细胞和牙周膜成纤维细胞的培养和生物学特征［J］.口腔医学研究，2002，18（6）∶375-378

　　［6］  曹正国，李成章，刘小平，等.中药黄芩苷对人牙周膜细胞增殖和总蛋白含量的影响［J］.口腔医学研究，2003，19（1）∶10-12

　　［7］  董广英，吴织芬，王勤涛，等.胰岛素对人牙周膜细胞DNA合成和细胞周期的影响［J］.实用口腔医学杂志，2003,19(3)∶260-262

　　［8］  董广英，吴织芬，王勤涛，等.hBMP2基因转染对人牙龈成纤维细胞生物学特性的影响［J］.牙体牙髓牙周病学杂志,2004,14(6)∶315-318

　　［9］  李成章，曹正国，杨茹，等.黄芩苷对牙龈成纤维细胞和牙周膜细胞pro- MMP- 1和MMP -3表达的影响［J］.中华口腔医学杂志，2004，39（3）∶197-200

　　［10］  陈发明，吴织芬，金岩.牙周组织工程研究进展［J］.中华口腔医学杂志，2004，39（6）∶520-522

　　［11］  鲁红，吴织芬，田宇，等. 细胞-支架构建方式的牙周组织工程实验研究［J］. 中华口腔医学杂志，2004,39（3）∶189-192

　　［12］  陈发明，吴织芬，金岩.引导牙周组织再生在伴牙槽骨缺损牙再植术中应用的回顾性研究［J］.口腔医学研究，2004，20（5）∶500-503

　　基金项目  国家高技术研究发展863计划（2002AA205041）“十五”国家科技攻关计划课（2004BA720A26）

　　作者简介  陈发明（1972~ ），男，安徽太湖人，博士，主治医师，主要研究方向为牙周组织再生与牙周组织工程。