4NQO饮水法诱发小鼠舌癌前病变模型建立的研究

　　作者：李武伟 马国武

　　【关键词】  4-硝基喹啉1-氧化物

　　［摘要］  目的：建立与人口腔癌前病变相似的动物模型。方法：采用0.001% 4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）饮水法对Balb/c近交系小鼠进行诱发实验。16周和20周时处死小鼠，观察病变情况。结果：舌背黏膜癌前病变的总发病率为100%。16周时以轻度和中度异常增生为主；20周时以中度和重度异常增生为主。结论：4NQO饮水法的致病过程和组织病理学特征与人相似；0.001% 4NQO饮用16~20周是舌癌前病变动物模型建立的理想时间。

　　［关键词］  4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）  舌  癌前病变  动物模型  小鼠

　　A Mouse Model of Tongue Epithelial Precancer Induced by 4-nitroquinoline l-oxide in Drinking Water.

　　LI Wu-wei, MA Guo-wu.

　　Oral Medical College of Dalian Medical University, Dalian 116027

　　［Abstract］Objective: To establish the precancerous animal model which is similar to the human occurrence. Methods: Chemical carcinogen 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO) in drinking water was administered  to 40 Balb/c mice of experimental group,10 mice were controled group. The mouse were killed and tongues were removed for histological assessment by the end of 16 or 20 weeks. Results: Gross changes included white changes and leukoplakia appearances on the posterior mucosa of the tongue dorsum were present during carcinogenesis. The histopathological changes ranged from hyperplasia are mild dysplasia and moderate dysplasia for 16weeks, moderate dysplasia and severe dysplasia are for 20 weeks. The total rate of precancer lesions is 100%. Conclusions: 4NQO can credibly cause mouse tongue precancer, which morphologically and histologically mimic human oral carcinnogenesis. The method by drinking water to cause mice oral precancer is natural and handy, and it is similar to the process of human oral precancer. The application of 0.001% 4NQO is the ideal period to precancer induction frome 16 to 20 weeks.

　　［Key words］  4-nitroquinoline 1-oxide(4NQO)  Tongue  Precancer  Animal model  Mouse

    应用动物模型研究口腔癌一直是口腔癌研究中应用最普遍、最有效的方法。迄今为止，以饮水方式诱发小鼠产生口腔癌前病变的研究在可见文献中未见报道。我们尝试用4-硝基喹啉1-氧化物（4-nitroquinoline 1-oxide ,4NQO）饮水法诱发小鼠产生舌黏膜癌前病变，成功地建立了动物模型。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  6周龄雄性清洁级Balb/c近交系小鼠50只（中国科学院上海实验动物中心提供），体重（23±2） g。实验条件：室温17~25 ℃，湿度40%~60%，以标准固体饲料喂养，24 h自然光暗循环。药品为4NQO（美国Sigma公司）。

　　1.2  实验方法　　　1.2.1实验分组  小鼠50只，随机分为2组：实验组40只，分别饮用4NQO 16周（20只）和20周（20只）；对照组10只小鼠，自由饮用普通自来水16周（5只）和20周（5只）。

　　1.2.2  给药方式  4NQO用蒸馏水配置成0.01%浓度，置4 ℃冰箱避光保存。用时以普通自来水稀释成0.001%浓度置避光瓶内自由饮用。每周更换实验组和对照组饮水2次。

　　1.3  观察指标

　　1.3.1  饮水量及体重  实验全过程中，每周观察记录一次小鼠的饮水量及体重。

　　1.3.2  舌黏膜  在乙醚轻微麻醉状态下，每2周观察记录一次小鼠的舌黏膜变化。

　　1.3.3  大体及组织病理学观察  16周及20周时，乙醚麻醉小鼠，颈椎拉脱位处死，立即解剖，取全舌、颊、腭、食道、前胃、肝、肺等组织标本，观察并标记测量标本的大体损害，于10%中性福尔马林液中固定。24 h后，乙醇梯度脱水，常规石蜡包埋，4 mm切片。每个样本切取舌前、中、后各3张切片进行HE染色，光镜下观察病理改变。病理诊断与分级参照WHO（1978）标准［1］。

　　1.4  统计学分析方法  所有数据均以均数±标准差(±s)表示，组间比较用卡方检验，P<0.05为检验标准。

　　2  结果

　　2.1  一般情况  实验全过程中小鼠无死亡，实验小鼠无明显毒副反应。各组间饮水量及体重无显著性差异（P>0.05）。

　　2.2  大体观察  16周和20周对照小鼠舌黏膜呈粉红色富有弹性，舌乳头分布均匀，舌体柔软，无白斑样改变，为正常小鼠舌黏膜外观。12周时个别实验小鼠（4/40）开始出现舌背后部黏膜白斑样变，范围小，约2~4 mm大小，14周时出现白斑样变小鼠增多（12/40），且改变逐渐明显，范围由后向前扩大。16周时半数实验小鼠（20/40）舌背后部黏膜呈片状白斑样改变，局部黏膜可出现1~2 mm大小白色斑点或斑块，呈1~2个灶性分布，略高出黏膜表面。20周时多数（35/40）实验小鼠舌背后部黏膜呈大面积白色斑片状改变，略高出黏膜表面，表面粗糙，可呈颗粒样外观，舌背人字沟附近的黏膜明显。实验小鼠舌背黏膜白斑样变均以舌背后部为重，其次为舌背中部，舌尖最轻。对照组及实验组小鼠舌黏膜均未见炎症和坏死。

　　2.3  组织病理学观察  对照组小鼠舌背黏膜上皮层次清楚，细胞排列正常，未发现上皮异常增生等变化，并随饮水时间的延长无明显变化。各组小鼠舌背黏膜病变诊断结果见表1。40只实验小鼠均出现了癌前病变，总发病率为100%（40/40），大体病变的程度与镜下异常增生的程度基本一致。对照组(16周和20周)舌背黏膜鳞状上皮层次清楚，钉突均匀，细胞形态正常，仅有2例（20%）黏膜上皮出现单纯性增生。16周时病变以轻度和中度异常增生为主（19/20），20周时以中度和重度异常增生为主（16/20）。16周时的轻度异常增生表现为棘层增厚，钉突伸长、变宽。20周时的中度异常增生表现为鳞状上皮明显增生，基底细胞层次增加，核浓染，棘层以上局部上皮可见明显增厚，见图1。20周时的重度异常增生表现为鳞状上皮显著增生，基底细胞呈多层样，核浓染增多，细胞及核异型性，滴状钉突相互融合，见图2。20周时舌背和舌尖的病变程度均较16周时舌背和舌尖的病变程度为重。病变周围均可见上皮的单纯性增生。

　　图1 － 图2  略

　　2.4  其他组织器官  颊、腭、食道、前胃、肝、肺等组织器官大体和镜下组织病理学检查未发现异常。

　　表1  各组小鼠舌背黏膜病变诊断结果　略

　　3  讨论

    口腔癌被普遍认为是由癌前病变发展而来。在应用化学致癌剂建立口腔癌动物模型的过程中，很多学者发现，癌形成之前口腔黏膜会出现类似于人类白斑的改变［2~4］。WHO认定白斑属于癌前病变。所以，建立口腔癌前病变动物模型对口腔癌的发病机制及预防和治疗的研究具有重要的意义。本研究表明，4NQO可以诱发Balb/c小鼠舌黏膜产生白斑样损害，即产生舌黏膜癌前病变；通过控制4NQO饮水时间可以产生不同程度的癌前病变；舌背后部病变明显、集中，与人口腔癌前病变的大体和镜下病理表现相似。 　　3.1  关于动物模型  口腔癌多为口腔黏膜上皮的鳞状细胞癌，其产生通常要经历由正常上皮→单纯性增生→异常增生→癌的变化过程，如何在癌前病变时期即上皮发生异常增生阶段及时进行预防和治疗从而阻断癌的发生将具有重要的意义。Salley用脂溶性化学诱癌剂二甲基苯并蒽（DMBA）涂布金黄地鼠颊囊产生了颊囊癌［5］，此后，DMBA涂布金黄地鼠颊囊诱发口腔癌的动物模型被认为是最成功的动物模型并沿用至今。但颊囊在解剖结构和组织学上与人相比有差异，故存在争论。Steidler和Hawkins用水溶性化学诱癌剂4NQO涂布法诱发小鼠产生了口腔癌［6，7］，产生的病变与人相似但诱癌方法不自然；而Ohne 等采用4NQO饮水法诱发大鼠产生了口腔癌［8］，诱癌方法自然但产生的病变与人差异较大。他们在成功建立口腔癌动物模型的同时均报道了发生癌前病变的情况。本实验选用小鼠作为实验对象，与地鼠或大鼠相比，与人的亲缘关系更近，且Balb/c小鼠对致癌因子敏感。所以，选用Balb/c近交系小鼠作为实验对象可以保证实验结果的准确性。实验结果表明，在小鼠口腔黏膜中，只有舌黏膜发生了癌前病变，食道、前胃、肝等其它部位和器官并未见到大体和镜下的损害。因此，虽然有学者提出小鼠不宜作为诱变口腔癌实验动物的观点［9］，但是，本实验结果说明，通过选择合适的强诱癌剂和采用适宜的诱变方法，我们认为仍然可以获得理想的实验结果。所以，以饮水方式诱发小鼠产生口腔癌前病变而建立的动物模型发病自然，与人类的发病过程相似。

　　3.2  关于4NQO和病变部位  4NQO属芳香胺杂环化合物，是一种前体致癌剂，在体内通过4NQO还原酶的作用形成近致癌物4-羟氨基喹啉-1-氧化物，进一步经脯氨酰基化作用代谢为终致癌物4-乙酰氨基喹啉-1-氧化物，最后与靶器官DNA亲核结构结合，形成DNA加成物，使鼠第7号染色体上H.ras1基因第12位密码子发生G→A转换等，致组织发生癌变［7］，其中4NQO还原酶起到关键作用。Tanaka报道实验动物中大鼠该酶含量最高，尤以舌背黏膜集中，后部显著高于前部［10］。本研究所诱发的病变最先出现在舌背黏膜，且病变多位于舌背后部人字沟附近，病变程度舌背后部普遍重于前部，说明小鼠的病变情况与大鼠相似。小鼠舌黏膜经历了由正常黏膜→单纯性上皮增生→异常增生→原位癌→早期浸润癌的典型病理变化，病损严重程度随药物作用时间的延长而逐渐加重，且癌前病变阶段较涂布法持续的时间长，适宜癌前病变的实验研究。

    虽然有2例原位癌和1例早期浸润癌发生，但病灶周围均可见到由轻度至重度的上皮异常增生，所以我们认为40只实验小鼠都发生了癌前病变，发病率达到100%；大体和镜下病理表现典型，与人的口腔病变相似，而对照组基本正常，说明本实验建模成功。20周较16周的上皮异常增生程度严重，且出现了原位癌和早期浸润癌，如继续用药，癌的比例将会增加。因此，我们认为用药16~20周是口腔癌前病变建模成功的理想时间。

    综上所述，4NQO饮水法诱发Balb/c小鼠舌癌前病变模型建立方法简单，靶器官代表性强，病变典型，具有与人口腔癌前病变相似的致病过程，为实验性口腔癌前病变研究提供了较理想的动物模型。

　　参考文献

　　［1］  WHO collaborating center for oral precancerous lesions. Definition of leukoplakia and related lesions: an aid to studies on oral precancer ［J］. Oral Surg Oral Med Oral pathol , 1978 ,46∶518 -539

　　［2］  Shklar G. The effect of methotrexate on chemical carcinogenesis of hamster buccal pouch ［J］. Cancer Res ,1966∶2218

　　［3］  邱存平 ,温玉明 ,王昌美.金黄地鼠舌癌模型的建立及其颈淋巴结转移［J］.口腔医学纵横杂志 ,2000 ,16 (1)∶10 -12

　　［4］  李文荟, 周磊, 耿华欧, 等. 舌癌动物模型的建立［J］. 广东医学院学报.2002,20(2): 85-86

　　［5］  Salley JJ. Experimental carcinogenesis in the cheek pounch of the Syrian golden hamster ［J］. J Dent Res ,1954 ,33∶253 -263

　　［6］  Steidler Ne, Reade PC . Experimental induction of oral squamous cell carcinomas in mice with 4-nitroquinoline-1-oxide ［J］. Oral Surg , 1984 ,57∶524 -531

　　［7］  Hawkins BL, Heniford BW , Ackermann DM , et al . 4NQO carcinogenesis: a mouse model of oral cavity squamous cell carcinoma ［J］. Head Neck , 1994 ,16∶424 -432

　　［8］  Ohne M, Satoh T, Yamada S, et al . Experimental tongue carcinoma of rats induced by oral administration of 4-nitroquinoline 1-oxide(4NQO) in drinking water ［J］. Oral Surg Oral Med Oral Pathol , 1985 ,59∶600 -607

　　［9］  章魁华 ,于世凤. 实验口腔病理学［M］. 北京: 人民卫生出版社, 2002∶113

　　［10］  Tanaka T, Makita H, Kawabata K , et al. 1,4-phenylenebis(methylene) selenocyanate exerts exceptional chemopreventive activity in rat tongue carcinogenesis ［J］. Cancer Res , 1997, 57∶3 644 -3 648