RANKL/RANK/OPG调节系统在牙周炎发病机制中的作用

　　作者：张晶 向晓明 李成章

　　【关键词】  骨吸收机制

　　近年来骨吸收机制的研究发现RANKL/RANK/OPG是调节破骨细胞分化成熟和骨吸收功能的关键因子，它不仅在生理性骨吸收中起重要作用，在病理性骨吸收（如类风湿性关节炎、骨质疏松等）中的也发挥着重要作用。牙周炎是以牙槽骨吸收为主要特征的慢性炎症，至今对其发病机制的认识仍不十分清楚，随着对RANKL/RANK/OPG研究的深入，发现RANKL/RANK/OPG在牙周炎发病机制中起重要作用。

　　1  RANKL/RANK/OPG调节系统

　　1.1  RANKL  RANKL（receptor activator of nuclear factor-κB ligand）又称TRANCE(TNF-related activation-induced cytokine)、ODF(osteoclast differentiation factor)或OPGL(osteoprotegerin  ligand)，是骨吸收的关键细胞因子，能刺激破骨细胞分化和发挥骨吸收功能［1］。它主要由成骨/基质细胞（osteoblast/stromal cells）、活化的淋巴细胞等表达。RANKL属于TNF配体超家族成员,有膜结合型（mRANKL）和可溶型(sRANKL)两种形式，mRANKL为Ⅱ型跨膜糖蛋白，由316个氨基酸组成，具有一个短的N末端胞内区［1］，sRANKL是由mRANKL的胞外段经蛋白酶水解形成的。两种形式的RANKL均能刺激破骨细胞分化和进行骨吸收，但mRANKL较sRANKL活性更大［20］。

　　1.2  RANK  RANK（receptor activator of nuclear factor-κB），是RANKL的功能受体，主要在破骨细胞前体和成熟破骨细胞表面表达。RANK是为Ⅰ型跨膜蛋白，包含616个氨基酸，其中184个氨基酸为胞外区，383个氨基酸为胞内区［2］。

　　1.3  OPG  OPG(osteoprotegerin)又称OCIF(osteoclastogenesis inhibitor factor)、TR1(TNF receptor-like molecule 1)，是RANKL的天然的可溶性诱导受体，多种细胞都可表达OPG，包括成骨/基质细胞、树突状细胞、B淋巴细胞以及内皮细胞前体和成纤维细胞前体等。OPG是TNF受体超家族成员，与其他TNF受体超家族成员不同之处在于它缺乏疏水的跨膜序列，为一种可溶性糖蛋白，由401个氨基酸组成。OPG在细胞外有双体和单体两种形式，两种形式OPG生理活性相同［3］。

　　1.4  RANKL/RANK/OPG调节系统  在骨吸收过程中，RANKL、RANK、OPG三者共同参与调节破骨细胞的分化、功能。当多种刺激骨吸收因子作用于成骨/基质细胞后，成骨/基质细胞在其表面表达RANKL，特异性的识别破骨细胞前体，并与其膜上的功能受体RANK结合，在M-CSF存在的条件下，将信号传入细胞内，刺激破骨细胞前体发育成成熟的破骨细胞［1］。同时，RANKL还能通过RANK途径，使成熟的破骨细胞内迅速形成肌动蛋白环，激活成熟的破骨细胞发挥骨吸收功能［4］。RANKL/RANK的作用能够被OPG抑制。OPG能够直接与RANKL结合，竞争性的抑制RANKL与RANK结合，进而抑制破骨细胞的分化和发挥功能［3］。同时，OPG还可与RANKL/RANK结合体结合形成三聚体，直接抑制RANKL/RANK的作用［14］。RANKL缺失或RANK缺失小鼠均出现骨吸收异常，发生严重的骨质硬化［5,6］。而OPG缺乏小鼠在出生后出现骨质疏松，加入重组OPG能够增加骨密度8］。由此可见，RANKL/RANK/OPG共同组成了调节破骨细胞分化、发挥骨吸收功能的一个关键环路调节系统。

　　2  RANKL/RANK/OPG调节系统与牙周炎

　　2.1  RANKL/RANK/OPG在牙周炎患者牙周组织中的表达Liu D等实验显示RANKLmRNA在重度牙周炎中的表达显著高于中度牙周炎和正常人群，而OPGmRNA在重度及中度牙周炎中表达则低于正常人群，RANKL/OPGmRNA之比为重度牙周炎>中度牙周炎>正常人群［9］。RANKLmRNA主要由炎症细胞表达（主要是淋巴细胞和巨噬细胞），炎症附近的上皮细胞也有少量表达［9］。

    Crotti T等取牙周炎骨吸收区周围的肉芽组织检测RANKL及OPG蛋白的表达，发现RANKL在牙周炎组织中的表达明显高于非牙周炎组织，相反，OPG在非牙周炎组织中表达明显高于牙周炎组织，同时，在炎症组织中单核细胞和部分多核细胞呈现为TRAP(+)，而正常组织中则没有，这说明破骨细胞前体发生了分化，这种作用可能由RANKL/RANK/OPG系统介导。在骨吸收区周围的肉芽组织中有许多T细胞（CD3+）浸润，其中30%的T细胞表达RANKL，巨噬细胞(CD68+)数量比T细胞少，约有一半的巨噬细胞表达RANKL，只有少量B细胞(CD22+)浸润，且不表达RANKL，这些炎症细胞在正常牙周组织中没有［10］。从以上实验可以看出，RANKL/RANK/OPG系统可能参与了牙周炎的牙槽骨的破坏，RANKL/OPG之比的下降可能是牙周炎进展的一个危险因素。

    但也有学者在检测牙周炎患者龈沟液中RANKL、OPG的浓度研究中发现，虽然牙周炎患者RANKL的浓度较正常组要高，OPG的浓度较正常组要低，但是其浓度与牙周炎的严重程度没有表现出明显相关性，RANKL、OPG及RANKL/OPG浓度之比均为轻度>中度>重度。分析其原因可能是随着病变程度的加重，组织中细胞量减少，参与分泌RANKL、OPG的细胞相应减少，因此，分泌到GCF中的量减少而产生该结果［11］。

　　2.2  RANKL/RANK/OPG在体外牙周组织培养中的表达  将牙周组织不同细胞体外培养，发现许多细胞均能表达RANKL/RANK/OPG。人牙龈成纤维细胞(HGFs)为牙龈的主要细胞成分。HGFs经E.coli LPS刺激后，OPG的表达升高，没有检测到有RANKL的表达。LPS与HGFs共培养的上清液能抑制单核细胞向破骨细胞的分化,加入抗OPG的抗体能抑制这作种用［12］。推测在牙周炎的骨破坏过程中HGFs可能起着保护性的作用。多种炎症介质能刺激HGFs产生OPG，HGFs在牙周炎局部免疫反应中可能受细胞因子调控而起保护作用。

    牙周组织很重要的一种细胞是牙周韧带细胞（PDLC），体外培养证明它能够产生RANKL、OPG，且OPG的量大于RANKL。与骨髓细胞共培养，无TRAP(+)MNC形成。只有当同时加入1,25-(OH)2D3/Dex和抗OPG抗体时，能诱导大量的TRAP(+)MNC产生，且这些TRAP(+)MNC具有骨吸收活性。说明PDLC产生的OPG能够抑制自身产生的RANKL，只有当OPG被抗OPG抗体完全中和后，PDLC产生的RANKL才能发挥作用［13］。由于PDLC位于牙槽骨和牙骨质之间，其分泌的OPG可能在抵御炎症组织中RANKL介导的骨吸收中发挥一定的防御功能。PDLC在抗原刺激和细胞因子刺激下产生RANKL、OPG的情况还未见相关报道，其在牙周炎中的作用有待进一步探讨。

    目前有学者发现牙龈卟啉单胞菌的LPS能刺激微血管内皮细胞表达OPGmRNA，但产生的OPG被牙龈卟啉单胞菌分泌的酶所消化，提示微血管内皮细胞也可能在牙周炎中起一定的保护性作用［7］。

    在牙周炎进展中，炎症细胞浸润增加，包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等。体外实验中，将活化的人B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞在M-CSF存在的条件下，与破骨细胞前体共培养，三者均表达高水平的RANKL，其中CD8+T细胞还表达大量的OPG，三者均不表达RANK。此外，CD4+T细胞和B细胞能支持破骨细胞的分化，而CD8+T细胞抑制RANKL诱导的破骨细胞的分化，但是加入抗OPG抗体不能扭转这种抑制作用，提示可能还有其他的抑制因子。因此该作者推测在牙周炎病理发生中B细胞可能起破坏作用，而CD8+T细胞起保护作用［15］。P.g还能在体外刺激单核细胞表达RANK、RANKL以及TNF-α，同时产生大量的TRAP(+)多核细胞，加入OPG能抑制60%~70%的破骨细胞的分化，说明单核细胞分泌的RANKL在细菌引起的骨吸收其主要作用，TNF-α可能也发挥了一定作用［16］。但是，Oda T等实验结果显示P.g外膜蛋白（OMP）刺激PBMCs表达高水平的IL-17，而 RANKL的水平明显低于IL-17，运用流式细胞分析仪检测无CD4+及CD8+T细胞表达RANKL，该文作者推测在P.g感染的牙周炎中浸润的T细胞产生的RANKL可能不起主要作用［17］。但考虑到P.g具有多种毒力因子，不同的毒力因子与T细胞作用产生的免疫应答不同，此实验结果仍不能否认T细胞产生RANKL在牙周炎中的作用。

　　2.3  RANKL/RANK/OPG在动物实验性牙周炎中的表达  Teng YT等用A.a-Hu-PBLCs- NOD/SCID小鼠模拟人牙周炎，发现A.a能够刺激人的CD4+T细胞产生RANKL，引起牙槽骨吸收，静脉注入OPG后，不影响牙周炎症，但能够减少病变区破骨细胞的数量，并抑制骨吸收。抑制其它的细胞因子都不能抑制骨吸收，说明RANKL/RANK在牙周炎牙槽骨破坏中可能起着关键作用。将A.a刺激后的CD4+T细胞在体外用P.g刺激，不产生RANKL，说明T细胞的RANKL的产生具有抗原特异性。而CD8+T细胞和B细胞在牙槽骨吸收中作用很小［18］。此实验有力的证明了抗原特异性T细胞产生的RANKL在细菌引起的牙槽骨吸收中的重要作用。另外，通过将活化的A.a-OMP特异性Th1细胞克隆静脉转移到小鼠体内，用局部抗原刺激构建的实验性牙周炎小鼠模型也证明，活化的T细胞表达高水平的RANKL，牙槽骨明显吸收。抑制T细胞的RANKL的表达，牙槽骨的吸收明显减少，且RANKL/OPG之比降低90%，表明RANKL/OPG之比的升高可能是牙槽骨吸收的关键因素［19］。

　　3  展望

    由于RANKL/RANK/OPG系统在骨吸收中的关键作用，研究其在牙周炎牙槽骨破坏中是否也具有关键作用对于弄清牙周炎病理机制具有重要作用。从目前的实验研究来看，牙周组织中的RANKL/RANK/OPG调节系统与牙槽骨的吸收存在着明显的相关性，但其是否具有关键作用还需实验证实。此外，许多因素能够促进或抑制RANKL/RANK/OPG的表达，但在牙周炎进展过程中，RANKL/RANK/OPG的调节机制较少有研究，进一步研究其在牙周炎牙槽骨吸收中的作用机制，对牙周炎的防治具有重要意义。

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