细胞外基质磷酸糖蛋白及其重要的结构片段

    作者：周晓燕综述 韦 曦审校    作者单位：中山大学光华口腔医学院·附属口腔医院牙体牙髓病科 广东 广州 510055

    【摘要】  细胞外基质磷酸糖蛋白（MEPE）是一种细胞外基质的非胶原性磷酸化糖蛋白，主要表达于骨组织、牙组织和肾近球小管中，在骨形成矿化以及调节磷吸收方面发挥重要作用。酸性丝氨酸-天冬氨酸-富集细胞外基质磷酸糖蛋白相关性基序与细胞外基质磷酸糖蛋白活性片段/AC-100多肽是MEPE的重要结构域，其生物学功能是近来研究的热点。

    【关键词】  细胞外基质磷酸糖蛋白； 酸性丝氨酸-天冬氨酸-富集细胞外基质磷酸糖蛋白相关性基序； 细胞外基质磷酸糖蛋白活性片段/AC-100多肽； 矿化

    AMatrix extracelluar phosphoglycoprotein and its important fragments  ZHOU Xiao-yan, WEI Xi. （Dept. of Conservative Dentistry and Endodontics, Guanghua School of Stomatology, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510055, China）

    [Abstract]  Matrix extracelluar phosphoglycoprotein（MEPE）, which is one of the matrix extracelluar non-collage-nous proteins, is expressed in bone, teeth and renal proximal convoluted tubules. It is considered to be a potentialphosphatonin. And it plays an important role in bone formation and mineralization. ARASM fragments and dento-nin/AC-100, motifs derived from MEPE, are the focus of recent research.

    [Key words]  matrix extracelluar phosphoglycoprotein； ARASM fragment； dentonin/AC-100； mineralization

    在2000年，Rowe等[1]从肿瘤相关性骨软化症（oncogenic hypophosphatemic osteomalacia，OHO）患者的肿瘤细胞cDNA文库中克隆到细胞外基质磷酸糖蛋白（matrix extracelluar phosphoglycopro-tein，MEPE）。OHO的特征是肾磷酸盐渗漏、低磷酸血症、低血清钙三醇和骨骼异常，而MEPE被认为是肿瘤分泌的调磷候选基因。mepe mRNA在OHO患者肿瘤组织中高表达，在正常组织和其他肿瘤中低表达[2]。MEPE在低磷性佝偻病/骨软化症包括X连锁显性低磷性佝偻病/骨软化症（X-linked hypophosphatemia rickets，XLH）、常染色体显性遗传性低磷性佝偻病（autosomal domi-nant hypophosphatemic rickets，ADHR）和OHO等疾病的发病机制中发挥了重要作用[1-4]。MEPE含有一些相对分子质量小但功能性较强的结构域，其中，酸性丝氨酸-天冬氨酸-富集细胞外基质磷酸糖蛋白相关性基序（acidic serine-aspartate-richMEPE-associated motif，ASARM motif，ASARM基序）与AC-100多肽是目前主要的研究热点。

    1  细胞外基质磷酸糖蛋白

    MEPE又称成骨细胞/骨细胞因子（osteoblast/osteocyte factor，OF）-45或骨调节蛋白（osteore-gulin），全长有1 989个碱基对，其cDNA克隆包含525个氨基酸残基、2个N-糖基化序列（NNST和NNSR）、1个位于第256～264氨基酸残基的葡萄糖胺聚糖附件（serine-glycineaspartokinase-gly-cine，SGDG）、1个位于第247～259氨基酸残基的整联蛋白结合三联体（arginine-glycine-aspartoki-nase，RGD）和数个N-豆蔻酰化位点和磷酸化接合基因序列[5]。

    MEPE为短整联蛋白黏合性配体互动糖蛋白（small integrin-binding ligand N-linked glycolpro-tein，SIBLING）远端基因家族成员之一，SIBLING非胶原性蛋白在骨的形成与代谢循环中具有重要作用，参与调节基质钙化、骨组织中的激素水平和对机械负荷的应答等[6-7]。该家族的其他成员还包括骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白（bonesialoprotein，BSP）、牙本质基质蛋白（dentin matrix protein，DMP）-1和牙本质涎磷蛋白[8]。仅从氨基酸序列的直接比较上并不能表明MEPE与这些蛋白属于同一家族，但是MEPE的某些特异性保守区域与SIBLING家族的其他蛋白质在结构上高度同源，例如MEPE的C末端包含ASARM基序（DDSSESSDSGSSSESD），这是SIBLNG蛋白家族的共同特点。此外，MEPE与SIBLING家族其余蛋白均定位于4q21.1，形成基因簇，MEPE位于BSP与OPN之间。MacDougall等[7]在对人类以及大鼠和猕猴属动物转录本中MEPE/OF-45的结构进行分析时发现，其至少含有5个外显子和4个内含子，表达于成牙本质细胞。故他们推测，MEPE可能是Ⅱ型和Ⅲ型牙本质发育不全等疾病的重要候选基因。Gowen等[9]发现，4和12个月的mepe基因敲除小鼠与野生型小鼠相比较，矿物质沉积率明显升高，老龄性骨量明显增加，体外培养的骨细胞矿化速度显著加快，骨松质组织计量学揭示基因敲除小鼠中骨量的增加是成骨细胞数目增加所致，即MEPE在小鼠的骨形成过程中起抑制作用。Liu等[10]在12周的小鼠试验中发现，mepe基因敲除对Hyp小鼠的骨骼异常发育无影响，原因可能与两者采用的试验动物的年龄不同有关。骨量主要是骨形成（发育早期）和骨改建（成年期）两个过程作用的结果，故提示MEPE可能在骨组织代谢循环的不同阶段发挥不同的作用。

    2  ASARM基序

    MEPE经过组织蛋白酶B作用后可以释放出ASARM基序，这是SIBLING家族成员一个重要的共同特点。ASARM基序是保守的蛋白酶降解序列，被磷酸化后可抵抗蛋白酶的水解作用，抑制骨组织矿化和肾脏对磷的摄取[11]。X染色体内肽酶同源性调磷基因（phosphate regulating genewith homologies to endopeptidases on the X chro-mosome，PHEX）是位于X染色体的调磷基因，编码产物为锌金属肽链内切酶，phex基因突变可引起调磷因子成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）-23过表达，后者是XLH的主要病因[3]。Rowe等[4]通过表面等离子共振（surface plas-mon resonance，SPR）证实，MEPE的ASARM基序与重组的可溶性PHEX之间以配体-受体的相互作用方式发生特异性结合，该作用呈剂量依赖性和锌依赖性。即PHEX蛋白可防止MEPE降解从而产生ASARM基序，phex基因突变使PHEX蛋白表达量降低，MEPE降解增加，ASARM基序抑制钙化，导致佝偻病表型或牙体组织矿化异常。Liu等[12]发现，磷酸化的ASARM多肽（phosphoryla-ted ASARM peptide，ASARM-PO4）能抑制MEPE与PHEX的相互作用并有效降低PHEX的酶活性，骨髓基质细胞（marrow stroma cell，MSC）中FGF-23明显升高，矿化受到抑制。以上研究提示，PHEX与MEPE相互作用的结合位点涉及ASARM基序。

    2008年，Martin等[13]在所建立的小鼠MSC共培养模型中分别加入ASARM多肽、抗ASARM抗体和1个依据PHEX锌结合基序合成的短肽SPR4（NH2-TVNAFYSASTNYPRSLSYGAIGVIVGHEFT-HGFDNNGRGENIADNG-OH，大小为4.2×103）并以放射性核素15N标记，采用SPR和1H/15N二维核磁共振检测所加入肽段的结合位点。结果显示，ASARM-PO4可抑制phex mRNA及其蛋白的表达，使FGF-23蛋白水平显著升高；另一方面，SPR4通过结合ASARM多肽促进phex mRNA及其蛋白的表达，证实ASARM基序可与PHEX发生特异性结合，下调phex基因的表达，发挥矿化抑制作用。SPR的放射性核素追踪结果进一步显示，MEPE-PHEX复合物的形成是通过ASARM与PHEX的锌结合位点发生特异性结合实现的，该过程需要锌的参与。同时，ASARM多肽可以降低成骨细胞标记物核心结合因子-α1、成骨细胞特异性转录因子、msx-2和骨钙蛋白的表达，并抑制成骨细胞和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）阳性细胞的产生，而加入SPR4共同孵育则能逆转该过程。

    3  细胞外基质磷酸糖蛋白活性片段/AC-100多肽链片段

    细胞外基质磷酸糖蛋白活性片段（dentonin）/AC-100多肽链位于MEPE的242～264序列，源于MEPE的中间保守序列，含有23个氨基酸残基的多肽链以及RGD和SGDG元件[2]。已有大量实验显示，骨形态发生蛋白（bone morphogeneticprotein，BMP）-2具有明显的成骨作用[14-15]，而2004年Hayashibara等[16]将dentonin注射到小鼠颅骨骨膜下发现，dentonin能促进成骨细胞增殖，刺激新骨形成，其刺激新骨形成的能力与BMP-2、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）-1和成纤维细胞生长因子（fibroblast growthfactor，FGF）-1相似。体外试验中，dentonin能刺激人原代成骨细胞的增殖，提高AKP活性，并可激活原位黏着斑激酶（focal adhension kinase，FAK）和细胞外信号调节蛋白激酶（extracellularsignal-regulated protein kinase，ERK）。Nagel等[17]发现，包含RGD和SGDG元件的dentonin能够促进人类MSC的增殖，使Ⅰ型前胶原、AKP表达升高，钙化结节形成增加。他们认为，dentonin诱导成骨细胞分化的作用可能通过诱导环加氧酶-2刺激地诺前列酮的自分泌和旁分泌实现。由于牙本质和骨组织的基质成分相似，故推测dentonin在牙本质形成中也可能具有调节作用。

    Liu等[18]通过5-溴脱氧尿苷免疫测定和细胞周期基因superarray检测发现，dentonin可通过下调P16和上调人泛素蛋白连接酶E3A和小泛素蛋白质相关修饰物（small ubiquitin-like modifier，SUMO）-1提高牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）的增殖能力，其促增殖作用需要完整的RGD或SGDG序列，即dentonin在牙髓的修复和DPSC的增殖过程中起重要作用。Six等[19]将dento-nin结合琼脂微球接种于大鼠磨牙牙髓断面，发现在牙髓损伤修复的初期，dentonin促进DPSC的增殖和向成骨细胞的分化，形成修复性牙本质，即dentonin主要影响牙髓修复早期阶段的细胞聚集和细胞增殖。Sprowson等[20]发现，dentonin能促进成骨细胞的附着、伸展和分化，细胞AKP活性升高，钙化结节形成增多。在此过程中完整的RGD-SGDG基序发挥了重要的作用，即RGD基序在SGDG的协调作用下，激活整联蛋白受体[21]，通过FAK和（或）ERK等递质启动下游信号通路，调节细胞的附着、迁移和增殖。该研究还显示，dentonin主要在成骨细胞分化的早期阶段发挥作用，对成熟的成骨细胞影响较小。原因可能在于dentonin通过整联蛋白受体活化FAK后，改变细胞与细胞外基质相互作用的动态平衡，诱导环加氧酶-2刺激地诺前列酮的分泌，而地诺前列酮主要在成骨早期发挥作用[22]。dentonin的相对分子质量较小，种属抗原性低，促成骨能力强，预测其是具有良好临床应用价值的蛋白分子。

    4  细胞外基质磷酸糖蛋白与机械载荷

    2005年，Gluhak-Heinrich等[23]采用小鼠尺骨模型证实，MEPE与DMP-1的表达受到机械载荷的影响。Gluhak-Heinrich等[24]建立小鼠载荷后牙齿移动模型，通过原位杂交和免疫组化检测牙槽骨细胞中MEPE和DMP-1在载荷前后的表达发现，MEPE在载荷初期下调，第3天上调至对照组的2.8倍，第7天则回落至正常水平，而DMP-1则持续上调。他们认为，在试验早期（载荷后第1天）和晚期（载荷后第4～7天），MEPE和DMP-1在牙槽骨改建过程中具有不同的调节作用，MEPE通过C端的ASARM多肽抑制矿化，N端区域则通过整联蛋白信号通路发挥对骨细胞的抗程序性细胞死亡功能，提示MEPE与DMP-1的基因产物在机械诱导骨改建中发挥了相互协调但不同的作用。此外Turner等[25]认为，载荷后骨细胞陷窝周围的局部脱矿可改变骨细胞的局部钙磷水平，进而改变骨细胞中MEPE的表达。在机械载荷引起骨改建的过程中，MEPE蛋白主要分布于牙槽骨新骨形成和骨吸收部位的骨细胞内，在成骨细胞中没有MEPE的表达，这与Nampei等[26]的报道一致。

    5  结束语

    作为SIBLING蛋白家族成员，MEPE对骨和牙的形成和发育有着重要的作用，同时也是调节体内磷酸盐平衡的关键分子。目前，有关MEPE在牙发育和再生方面的研究尚不多，ASARM基序和dentonin/AC-100的作用机制也未完全明确。因此，进一步探讨MEPE在牙髓牙本质复合体修复再生中的作用机制及其应用，可为临床上牙髓损伤的保存治疗开辟新的途径。另外，利用MEPE与dentonin/AC-100的促成骨作用，开发其修复骨细胞损伤的潜能，对于牙周炎和牙槽骨萎缩等骨缺损疾病的治疗也具有潜在的临床应用价值。

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