犬急性心房颤动时心房尿激酶型纤溶酶原激活物表达的变化

　　作者：潘为涛1，陈国桢2，蔡若蔚2，吴立春3，郑伯仁1 作者单位：1.福州市第二医院心内科，福建 福州　350007;2.福建医科大学附属第二医院心内科;3.岳阳市第二人民医院ICU科

　　【摘要】 目的：研究犬急性心房颤动(房颤)时心房内皮细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)蛋白表达的变化，探讨房颤时心房附壁血栓形成的可能机制。方法：取12只健康成年杂种犬，随机分为两组：快速心房起搏(RAP)组(6只)：建立犬急性房颤动物模型;正常对照组(6只)：仅给予开胸，不进行起搏。分别取两组犬的左心耳、右心耳部位心肌组织，应用免疫组织化学技术检测心耳内皮细胞u-PA蛋白表达的改变。结果：(1)RAP组所有犬均可诱发出阵发性房颤;(2)RAP组犬心耳内皮细胞均未见u-PA蛋白表达，正常对照组u-PA蛋白表达阳性率为75.0%，RAP组u-PA蛋白阳性率显著低于正常对照组的(P<0.001)。结论：急性房颤时心耳内皮细胞尿激酶型纤溶酶原激活物水平下降，提示在房颤早期内皮细胞纤溶储备功能降低，这可能与房颤时附壁血栓形成有关。

　　【关键词】 心房颤动,尿纤溶酶原激活物,血栓形成

　　Abstract：Objective：To investigate change of expression of urokinase-type plasminogen activator (u-PA) in atrial endothelial cells in dogs with acute atrial fibrillation (AF)，and study the possible mechanism of formation of atrial mural thrombosis during AF. Methods：A total of 12 healthy adult dogs were randomly divided into rapid atrial pacing group (RAP group，n=6，established acute AF model with rapid atrial pacing) and normal control group (n=6，only received thoracotomy without pacing). Immunohistochemistry was used to detect change of u-PA expression in endothelial cells from left and right auricular appendages of the dogs. Results：(1) Paroxysmal AF was induced in all dogs in RAP group;(2) No u-PA expression was observed in endothelial cells of auricular appendages in RAP group while positive rate of u-PA was 75.0% in normal control group，positive rate of u-PA in RAP group was significantly lower than that of normal control group (P<0.001). Conclusion：Level of urokinase-type plasminogen activator decreases in endothelial cells of auricular appendage during acute atrial fibrillation，suggesting that endothelial fibrinolytic reserve decrease in early period of atrial fibrillation，which may be related with formation of mural thrombosis during atrial fibrillation.

　　Key words：Atrial fibrillation;Urinary plasminogen activator;Thrombosis

　　心房颤动(房颤)是临床上最常见的快速型心律失常，并且是脑卒中和死亡的独立危险因素之一 [1]。临床研究表明，房颤引起体循环血栓栓塞与房颤时高凝状态(或血栓前状态)有关 [2-6]。本研究通过建立犬急性心房颤动模型，观察心耳内皮细胞胞浆尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)含量的改变，探讨急性房颤时心房内膜内皮细胞纤溶储备功能的改变。

　　1　资料与方法

　　1.1　研究对象

　　成年健康杂种犬12只，雌雄不限，体重14～24，(18.0±2.5)kg，分为两组：快速心房起搏(RAP)组和正常对照组，每组6只。两组犬在性别、体重方面无显著差别。本实验严格执行国家有关实验动物管理的规定。

　　1.2　研究方法

　　1.2.1　动物模型建立：两组犬腹腔注射3%戊巴比妥(北京化学试剂有限公司)30mg/kg麻醉，其量根据麻醉情况，术中适量经静脉追加。经左侧第四肋间后外侧切口入胸，RAP组分别在心房中部、左心室前壁缝置一5F双极电极(美国St.Jude Medical Inc)，左心房双极电极尾端连接DF-5A型心脏电生理刺激仪(苏州工业园区东方电子仪器厂)，左心室双极电极尾端连接AXQ-3按需心脏起搏器(上海医用电子仪器厂)。通过左心房电极，予以脉冲频率400次/min的快速心房刺激诱发房颤，分别持续30秒、60秒，各重复刺激2次，记录房颤诱发次数及持续时间。如果单纯快速起搏不能诱发出房颤，再给予心室起搏+心房起搏，直至重复诱发出房颤为止。记录房颤诱发次数及持续时间。诱发房颤定义为可重复诱发出3次以上、持续时间超过1min的房颤。正常对照组仅予以开胸手术而不进行起搏。

　　1.2.2　取材：RAP组在房颤成功诱发后心脏停跳之前，正常对照组在行开胸手术后，各取左右心耳组织100mg左右，生理盐水冲洗干净后立即置入液氮中保存，然后转入-80℃深低温冰箱保存待测。

　　1.2.3　心房组织环氧化酶(COX)-2免疫组织化学检测：石蜡切片脱蜡、水化、磷酸盐缓冲液(PBS)(pH7.4)冲洗后，每张切片加50μl的鼠抗人uPA单克隆抗体(福州迈新生物技术开发公司)室温下孵育60min，PBS冲洗，每张切片加50μl 即用型MaxVisionTM 试剂，室温下孵育15min。除去PBS液，每张切片加100μl新鲜配制的3,3′-二氨基联苯(DAB)溶液，自来水冲洗，苏木素复染，PBS冲洗返蓝，梯度酒精脱水干燥，中性树胶封固。阳性判断标准：以阳性细胞比例及阳性色泽强度为准。表1　尿激酶型纤溶酶原激活物阳性细胞比例及阳性色泽强度阳性细胞数

　　1.3　统计分析

　　统计处理均由SPSS 12.0软件包完成，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，用t检验测显著性。计数资料以%表示，比较采用x2检验与Fisher确切概率法，P<0.05为差异有显著性。

　　2　结　果

　　2.1　房颤动物模型的建立

　　RAP组所有6只犬均诱发出房颤，如图1所示。图1　6只犬诱发房颤心电图图1-a：起搏前体表心电图(Ⅱ导联)，为窦性心律;图1-b：房颤心电图(Ⅱ导联)，p波消失，代之频率、幅度各异的f波，频率为350～600次/min，等电位线消失，R-R间期绝对不齐。

　　2.2　u-PA蛋白免疫组化表达

　　免疫组化检测中，u-PA阳性表达主要表现为棕褐色细颗粒，主要分布在细胞膜与细胞浆，胞核无染色。纵切面视野阳性颗粒沿胞膜、胞浆分布。在心内膜与心肌血管内皮细胞均有不同程度的表达，在心肌组织不表达。如表2所示，房颤组6只犬心耳内皮细胞均未见u-PA蛋白表达(图2-a，见封四)，正常对照组u-PA蛋白表达的阳性率为75.0%(P<0.001)，见于内皮细胞胞浆，染色深(图2-b，见封四)。表2　两组u-PA表达水平比较

　　2.3　两组u-PA阳性率比较

　　每组取左、右心耳组织检测u-PA，正常对照组阳性率75%，显著多于房颤组(P<0.001)。

　　3　讨　论

　　心房快速起搏是建立房颤犬模型的有效方法。本研究应用快速心房起搏或心房起搏加心室起搏，诱发房颤的成功率高。这与既往研究结果是一致的。

　　本研究采用免疫组化技术检测犬心耳内皮细胞u-PA含量，结果表明房颤组6只犬均为阴性(见表2)，与正常对照组有显著差别(P<0.001)，提示在正常犬的心耳内皮细胞内，有一定的u-PA储备;在房颤早期，心耳内皮细胞u-PA的储备就可能发生减少。

　　u-PA属于丝氨酸蛋白水解酶，在纤溶系统中起重要作用，主要通过与u-PA受体(u-PAR)结合发挥纤溶作用。细胞合成u-PA后把它运输到细胞表面与u-PAR结合，激活纤溶酶原成为纤溶酶，从而引发一系列的蛋白水解反应。但u-PA自身也具有一定的功能：作用于生理、病理条件下的细胞迁移和组织修复，介导细胞外基质蛋白的水解、裂解Ⅳ 型胶原酶，将纤溶酶原激活为纤溶酶，间接激活其他蛋白水解酶以及直接降解细胞外基质及基底膜。另外，纤溶酶本身还可以直接裂解pro—uPA为u-PA，从而形成一个正反馈环[7]。

　　国内外大量临床研究显示，慢性房颤患者存在高凝状态，表现为血小板功能、凝血-抗凝、纤溶-抗纤溶、内皮功能的改变/受损。Mitusch等[8]报道房颤患者血浆组织型纤溶酶原激活物(t-PA)水平明显升高，而纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)与窦性心律者无显著差异，而Roldn等[4]却发现房颤时血浆PAI-1水平明显升高，t-PA水平则轻度下降。以上研究的缺陷是所研究的对象均为慢性房颤患者，多合并有基础性疾病如冠心病、风湿性心瓣膜病、高血压等，这些疾病本身就有潜在的凝血或纤溶平衡的紊乱，如冠心病患者血浆PAI-1活性增强，而t-PA改变不明显[9]，风湿性心脏病二尖瓣狭窄也可激活血小板功能和凝血系统[10]，从而对纤溶系统产生影响。本研究采用犬急性房颤动物模型，排除了基础性疾病的影响，发现急性房颤时存在内皮细胞纤溶储备的改变，这种改变有可能是房颤本身引起的。本研究由于实验条件的限制，未能采用敏感性更高的技术来检测u-PA含量的改变，未能对u-PA含量减少的机制进一步进行探讨，有待今后进一步研究。

　　【参考文献】

　　[1]Wolf PA，Abbott RD，Kannel WB.Atrial fibrillation as an independent risk factor for stroke：the Framingham Study[J].Stroke,1991,22(8)：983-988.

　　[2]Lip GY.Does atrial fibrillation confer a hypercoagulable state[J].Lancet,1995,346(8986)：1313-1314.

　　[3]Lip GY，Lowe GD，Rumley A，et al.Increased markers of thrombogenesis in chronic atrial fibrillation：effects of warfarin treatment[J].Br Heart J,1995,73(6)：527-533.

　　[4]Roldán V，Marín F，Marco P，et al.Hypofibrinolysis in atrial fibrillation[J].Am Heart J,1998,136(6)：956-960.

　　[5]Conway DS，Pearce LA，Chin BS，et al.Plasma von Willebrand factor and soluble p-selectin as indices of endothelial damage and platelet activation in 1321 patients with nonvalvular atrial fibrillation：relationship to stroke risk factors[J].Circulation,2002,106(15)：1962-1967.

　　[6]吴光哲，郑　兴.慢性房颤C反应蛋白、白介素、纤维蛋白原与前血栓状态的关系[J].心血管康复医学杂志，2005,14(5)：500-501.

　　[7]胡金勇，曾　英，桑玉英，等.尿激酶型纤溶酶原激活剂的研究[J].细胞生物学杂志，2001,23(2)：67-71.

　　[8]Mitusch R，Siemens HJ，Garbe M，et al.Detection of a hypercoagulable state in nonvalvular atrial fibrillation and the effect of anticoagulant therapy[J].Thromb Haemost,1996,75(2)：219-23.

　　[9]Pedersen OD，Gram J，Jespersen J.Plasminogen activator inhibitor type-1 determines plasmin formation in patients with ischaemic heart disease[J].Thromb Haemost,1995,73(5)：835-840.

　　[10]Jafri SM，Caceres L，Rosman HS，et al.Activation of the coagulation system in women with mitral stenosis and sinus rhythm[J].Am J Cardiol,1992,70(13)：1217-1219.