复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜对猪髂动脉内皮细胞生长的影响

　　作者：刘　雯，李　健，安　毅 作者单位：青岛大学医学院附属医院心内科，山东 青岛　266100

　　【摘要】 目的：观察复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜对培养的猪髂动脉内皮细胞生长的影响。方法：将猪髂动脉内皮细胞接种于裸钴铬合金片膜(裸金属支架组)、雷帕霉素药物涂层钴铬合金片膜(雷帕霉素支架组)、复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜钴铬合金片膜(抗温敏膜组)，培养24h。在光镜下观察细胞形态，以活细胞计数器(CCK-8)测定细胞增殖;以酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定各组血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍化生长因子(PDGF)的水平。结果：动脉内皮细胞在抗温敏膜上生长良好，形态正常。培养24h，与裸金属支架组、雷帕霉素支架组比较，在抗温敏膜上存活的内皮细胞[光密度值：(0.812±0.003)、(0.783±0.005)比(0.903±0.003)]，VEGF水平[(11.583±1.281) ng/L、(9.145±1.065) ng/L比(19.731±2.773) ng/L]显著升高，PDGF水平显著降低[(113.627±17.369) ng/μl、(91.251±17.097) ng/μl比(66.278±18.045) ng/μl]，P均<0.05。结论：复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜有助于血管内皮细胞的增殖。

　　【关键词】 壳聚糖;内皮细胞;内皮生长因子;血小板源性生长因子

　　Abstract：Objective：To observe influence of influence of hydroxybutyl-chitosan nanoparticles carries CD133+anti-thermosensitive membrane on growth of endothelial cells of pig iliac artery. Methods：Endothelial cells of pig iliac artery were cultured on bare cobalt-chromium alloy film (bare metal stent group)，rapamycin-eluting cobalt-chromium alloy film (rapamycin stent group) and influence of hydroxybutyl-chitosan nanoparticles carries CD133+anti-thermosensitive membrane cobalt-chromium alloy film (anti-thermosensitive membrane group) respectively for 24h. Cell forms were observed under light microscope and cell proliferation was measured by cell counting kit-8 (CCK-8). Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was used to measure levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet derived growth factor (PDGF) in all groups. Results：Arterial endothelial cells grew well on anti-thermosensitive membrane and cell forms were normal. Compared with bare metal stent group and rapamycin stent group after 24h-culturing，there were significant increase in number of endothelial cells [optical density：(0.812±0.003)，(0.783±0.005) vs. (0.903±0.003)]and VEGF level [(11.583±1.281) ng/L，(9.145±1.065) ng/L vs. (19.731±2.773) ng/L]，and significant decrease in PDGF level [(113.627±17.369) ng/μl，(91.251±17.097) ng/μl vs. (66.278±18.045) ng/μl]in anti-thermosensitive membrane group，P<0.05 all. Conclusion：Influence of hydroxybutyl-chitosan nanoparticles carries CD133+anti-thermosensitive membrane can improve proliferation of vascular endothelial cells.

　　Key words：Chitosan;Endothelial cells;Endothelial growth factors;Platelet-derived growth factor

　　我国目前每年有超过10万余例患者接受支架治疗，且以每年约30%的速度增长。裸金属支架植入术后，发生支架内再狭窄的病例约占20%～30%;雷帕霉素、紫杉醇等药物涂层支架，虽对支架内再狭窄起到了有效控制作用，但尚存在因内皮延迟愈合而导致的再狭窄及延迟血栓形成的危险。因此，研究能够促进血管内皮增殖从而降低支架内再狭窄发生的新型支架成为热点。目前有关复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜对猪髂动脉内皮增殖的影响未见报道，本实验旨在观察复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜对培养的血管内皮细胞生长的影响。

　　1　资料与方法

　　1.1　材料

　　高糖DMEM(购自Hyclone公司)、胎牛血清、胰蛋白酶、活细胞计数器(CCK)-8、血管内皮生长因子(VEGF)-酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(均购自碧云天生物技术研究所)、猪血小板衍化生长因子(PDGF)-ELISA试剂盒(购自上海江莱生物科技有限公司)。猪髂动脉内皮细胞株(PIEC)由武汉博士德生物工程有限公司提供。钴铬合金片膜及雷帕霉素涂层钴铬合金片膜由上海微创公司制备，复合纳米载体羟丁基壳聚糖携载CD133+抗体温敏膜由中国海洋大学制备。

　　1.2　细胞培养

　　PIEC采用20%胎牛血清、300 μg/ml L-谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素和25 IU/ml链霉素的高糖DMEM培养基培养，在37℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养，实验时取对数生长期细胞。

　　1.3　实验分组

　　本实验分为裸钴铬合金片膜组(裸金属支架组)、雷帕霉素药物涂层钴铬合金片膜组(雷帕霉素支架组)、复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜组(抗温敏膜组)。

　　1、4　以CCK-8试剂盒进行内皮细胞增殖分析

　　选对数生长期的猪髂动脉内皮细胞，分别接种到放有三种不同支架的培养瓶中，以含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养24 h后，吸取培养液，每组重新加入高糖DMEM培养基，再加入CCK-8，孵育2 h后，检测450nm光密度(OD)值。

　　1.5　以VEGF-ELISA试剂盒测定VEGF水平

　　取各组离心后上清液按VEGF-ELISA试剂盒的说明书操作，测得各组VEGF水平。

　　1.6　以PDGF-ELISA试剂盒测定PDGF水平

　　取各组离心后上清液按PDGF-ELISA试剂盒的说明书操作，测得各组PDGF水平。

　　1.7　统计学处理

　　应用SPSS 13.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，两组间比较采用非配对t检验，P<0.05为差异有显著性。

　　2　结　果

　　2.1　光镜下各组细胞的形态

　　描述：光镜下可见抗温敏膜组猪髂动脉内皮细胞生长状况良好，贴壁正常，细胞呈典型的圆形或卵圆形，形态一致，较裸金属支架组及雷帕霉素支架组无明显增大或缩小，有较多细胞伸出伪足。见图1(封二)。

　　2.2　各组细胞在450nm的光密度值、VEGF水平及PDGF水平

　　培养24 h，与裸金属支架组、雷帕霉素支架组比较，在抗温敏膜上存活的内皮细胞(光密度值)、VEGF水平显著升高，PDGF水平显著降低(P均<0.05)。见表1。表1　三组光密度值，血管内皮生长因子及血小板衍化生长因子水平比较

　　3　讨　论

　　目前介入治疗已成为治疗冠心病尤其急性冠脉综合征的最有效方法，而支架内再狭窄的发生成为困扰介入发展的医学难题。壳聚糖是脱乙酰基的几丁质，其基本单位是N-乙酰-D-氨基葡萄糖，因其具有特有的黏膜黏附性，成为新型的纳米药物载体[1]。有研究表明壳聚糖具有优良的促进血管内皮细胞生长的作用[2,3]和抗动脉粥样硬化作用[4]。利用壳聚糖和磷脂化壳聚糖制备的血管支架涂层膜有助于血管内皮细胞的增殖和迁移[5]，壳聚糖/肝素复合涂层膜不仅具有良好的稳定性，还有极显著的抗支架血栓作用，同时由于壳聚糖材料对温度相对稳定，不会因为长期处于体内较温和的环境下而发生变形或收缩等现象，使壳聚糖作为新型血管支架涂层材料显示出很大的优势[6]。内皮祖细胞在定向分化之前高表达CD133[7]，可见在支架表面涂有CD133的抗体，可直接和自体循环中的内皮祖细胞表面的CD133结合，捕获有分化能力的内皮祖细胞，快速促进内皮愈合，有效降低术后支架内再狭窄的发生率。VEGF是一种作用于血管内皮的生长因子，它能刺激血管内皮细胞的增殖，促进血管的生成[8,9]，有效降低支架内再狭窄的发生。PDGF具有刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞、角质细胞分裂增生的作用，同时对中性粒细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞具有趋化作用。平滑肌细胞增殖同时可继发表达PDGF，进一步促进平滑肌细胞的增殖与迁移。有研究证实，大鼠的动脉平滑肌增生和PDGF水平呈正相关[10]。因此减少PDGF的表达可抑制平滑肌细胞的过度增殖，有利于血管内皮的愈合。

　　本研究证实复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜较裸金属支架、雷帕霉素药物涂层支架能更好地促进血管内皮细胞增殖，且VEGF水平明显较其它两组高，PDGF水平明显较其它两组低，进一步促进了血管内皮细胞的增殖。实验表明复合羟丁基壳聚糖纳米载体携载CD133+抗体温敏膜做成的支架能够促进血管内皮细胞的增殖，有望解决支架内血栓形成和内皮生长延迟的介入难题，从而为最终解决支架内再狭窄提供新的思路。

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