非综合征性唇腭裂与TGFβ2多态性的相关研究

作者：焦晓辉　王丽

【关键词】  唇腭裂

　　［摘要］  目的：探讨转移生长因子β2(transforming growth factor-β2,TGFβ2)多态性与非综合征性唇腭裂（nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate, NSCL±P）的相关性。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态（PCR-SSCP）方法，以103名健康体检者为对照，配对研究了124名非综合征性唇腭裂患者TGFβ2基因的多态性。结果：对照组与患者组TGFβ2两者相比较，在统计学上有显著性差异（X2=16.235，df=1,P<0.005）；单独发生唇裂或腭裂者与唇腭裂同时并发者比较，在统计学上有显著性差异（X2=15.885，df=1,P<0.005）；其他配对比较均无统计学意义。结论：非综合征性唇腭裂的发生与TGFβ2基因多态性有相关性。

　　［关键词］  唇腭裂  遗传学  转移生长因子β2  多态性

　　Evidence for Association between Nonsyndromic Cleft Lip with or without Cleft Palate and Transforming growth factor-β2 Polymorphisms.

　　JIAO  Xiao-hui, WANG  Li.

　　The dental hospital Affiliated Hospital of Harbin medical university, Harbin 150001

　　［Abstract］Objective: To study the relationship between transforming growth factor-β2（TGFβ2） polymorphisms and nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL±P) . Methods: TGFβ2 was examined by polymerase chain reaction-single strand conformation polymprphism (PCR-SSCP) technique  in the 124 patients with NSCL±P and 103 healthy persons. Results: In the comparisons between the controls and the patients, the patients with cleft lip or cleft palate and the patients with cleft lip and palate,  the results were respectively（X2＝16.235,df=1,P<0.005；X2＝15.885,df=1,P<0.005）. So there was statistical significance. In other comparisons, there was no statistical significance. Conclusion: The above results give strong evidence for the association of TGFβ2 with development of NSCL±P.

　　［Key words］  Cleft lip and palate  Genetics  Transforming growth factor-β2  Polymorphism

    非综合征性唇裂伴或不伴腭裂（nonsyndromic cleft with or without cleft palate, NSCL±P）是胚胎发育过程中腭突融合不全所致，这是新生儿畸形中最常见的一种，发生率为0.80‰~1.00‰。在所有唇腭裂患者中，大部分以非综合征形式表现出来，约占50%~70%,而且由于不同人种5个病人中就有1名有唇腭裂（CLP）家族史，遗传性因素被认为起重要作用。目前，已证实6p24、2p13、19q13、1q41 、17q21、14q24均与CL±P的发生有关联。TGFβ2与人类1q41匹配，Nishimura［1］ ，Ausuko等［2］的研究表示TGFβ2与NSCL±P的发生有明确相关性。大量的研究是以西方人种作为研究对象，对亚洲人种相类似的研究甚少，因此，我们观察了中国北方地区唇腭裂发生情况，分析了TGFβ2基因多态性与NSCL±P的相关关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  对象  自2000年9月至2001年3月，在哈尔滨医科大学附属第二医院口腔颌面外科就诊的唇腭裂患者，排除为我们所了解的例如范伍德综合征、歌舞伎面谱综合征、MECKEL综合征、腭心面综合征患者，并确认母亲怀孕期间无外伤史和服药史等，就诊中为NSCL±P的124名。为比较TGFβ2是否与唇腭裂严重程度相关，把患者按唇腭裂严重程度划分为4组，分别为：单侧唇裂包括有单侧唇裂伴牙槽嵴裂和隐性唇裂(Cleft Lip, CL)、单纯性腭裂(Cleft Palate only, CPO)、单侧唇裂伴腭裂(unilateral Cleft Lip and Palate, UCLP)和双侧唇裂伴腭裂(bilateral Cleft Lip and Palate, BCLP)。另外，为显示TGFβ2是否与唇腭裂家族史相关，把患者分成有家族史（Family History, FH）和无家族史(without Family History, WFH)两组。随机选取哈尔滨医科大学附属第二医院体检的103名健康人为对照组(controls, C)，且家族中无唇腭裂患者。在所有研究对象中均无血缘关系。

　　1.2  基因多态性检测

　　1.2.1  基因组DNA提取  抽取外周静脉血5 mL，枸橼酸钠抗凝，采用常规酚-氯仿抽提法提取DNA。

　　1.2.2  TGFβ2基因分型  反应引物按Hang［3］设计等报道，由上海生工生物工程公司合成。TGFβ2 引物上游序列为：5’-CGA CGA CAA CGA TGA TGC TT-3’，下游序列为：5’-TAC GTA CAG CAA CTC CAC TT-3’。PCR括增含有多态性基因片段，在Perkin-Elemer 9600型热循环仪上进行。反应体系为30 μL，其中包括基因组DNA0.4 μL，引物各1.0 μL，4×dNTP1.0μL,MgCl2 2.0 μL,5 mmol TaqDNA聚合酶0.4 μL，10×缓冲液3.0 μL，ddH2O2 1.2 μL。PCR反应条件见表1。取PCR产物5 mL,进行常规聚丙烯酰胺非变性胶电泳、银染，观察电泳结果并保存记录。

　　表1  TGFβ2 PCR反应条件（略）

　　1.2.3  TGFβ2基因型检测

　　1.3  数据处理  计算各组等位基因和基因型频率，吻合度检验确定是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。X2检验，比较各组基因多态性差异。对TGFβ2各等位基因和基因型与NSCL±P进行关联分析。

　　2  结果

　　2.1  TGFβ2  TGFβ2定位于1q41，在3′非编码区由于含322 bp等长片段含有的ACA重复序列不同而出现3种等位基因［4］。A2为常见的等位基因，含有8个ACA重复序列，广泛存在于病人和正常人中。A1、A3为相对异常或较不普遍的等位基因，分别含有7个、9个ACA重复序列。PCR扩增产物经琼脂糖检样结果见图1。各等位基因通过常规聚丙烯酰胺变性胶电泳结果见图2。根据保存的电泳结果按CL、CPO、UCLP、BCLP及对照组划分统计各等位基因的频数及基因型结果见表2。 根据保存的电泳结果进行有无家族史的统计学比较，结果见表3。在TGFβ2的基因多态性与CL±P的关联性分析中，将患病组（patients, P）与对照组（control, C），CL/CPO与CLP，CL与CPO，UCLP与BCLP，FM与WFH进行配对比较，统计学分析结果见表4。

　　图1  PCR括增产物琼脂糖检样结果　略

　图2  TGFβ2扩增产物经SSCP方法电泳结果　略

　　2.2  TGFβ2基因多态性与NSCL±P的关系  TGFβ2的基因频率在患病组与对照组比较中，X2=

　　表2  TGFβ2各等位基因及基因型频率　略

　　表3  家族性TGFβ2等位基因频数及基因型频数　略

　　表4  TGFβ2基因多态性与CL±P的关联性分析　略

　　3  讨论

    唇腭裂是人类最常见的先天性畸形之一。流行病学调查数据提示NSCL±P有明显的家族集中性。故许多学者认为非综合征性唇腭裂的最主要的病因是遗传因素。大约2~20个基因相互作用可导致NSCL±P的发生，说明NSCL±P的致病基因具有异源性，其中主基因能导致10%~50%的NSCL±P发生。

    在我们的研究中，挑选了TGFβ2来比较黄种人与白种人唇腭裂发生的基因或位点的差异，确定黄种人唇腭裂的主基因和位点，以便应用于临床基因诊断和基因治疗，最终达到降低发病率，实现优生优育、提高民族素质的目的。

    转移生长因子β2（TGFβ2）是控制细胞分化和增殖的多肽家族中的成员。成熟的TGFβ2包含112个氨基酸单体，这些单体是从含422个氨基酸的原蛋白羧基端分裂出来的［5］。Nishimura［1］运用探针技术采用PCR-SSCP和PCR-Sac I分析方法得出亚洲人、黑人、高加索人中TGFβ2对唇腭裂的发生有影响，还发现TGFβ2相邻的HLX1基因可能与TGFβ2有协同作用影响胚胎面部正常的联合、融合而致畸。

    TGFβ2在正常人与患病组之间的比较中有统计学意义，与Atsuko等［2］的报道研究一致，与Andrew C等［6］的不一致，可能由于人种群体不同或我们的对照组正常例数相对较多与患病组例数相对均衡而致。同样在唇裂或腭裂单发者与并发者比较中有明显统计学意义，提示序列多态性与疾病严重程度有正相关关系，这又与后面单侧唇裂并发腭裂与双侧唇裂并发腭裂相比较的统计学数据背道而驰，出现这样的结果可能有3个：1）样本数量有限，仅对124名患者进行比较，有一定误差；2）选取对象不同，主要集中在北方地区，覆盖面不够广泛；3）不同于其他人的实验设计方案也会导致这样的阴性结果，西方人往往进行大量的家系性研究。在家族史有无的比较中，也呈现阴性结果，其主要原因是家系提供的研究血样有限，家族病史的例数有限。

    TGFβ族包括TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3，其中任何一个成员缺失，其他基因在某种程度上会代偿这种缺失，但不可能完全代偿。因此，我们提出 TGFβ2的某种多态性与其他因素互相影响最终导致唇腭裂发生。NSCL±P的发生还与药物、化学物质、物理因素、环境、感染因素等有关，作为基因遗传病在同时存在其他诸多因素的情况下会使个体更加易感。

　　参考文献

　　［1］    Nishimura DY, Purchio AF, Murray JC, et al. Linkage localization of TGFB2 and the human homeobox gene HLX1 to chromosome 1q ［J］. Genetics, 1993,15∶357-364

　　［2］  Ausuko Tanabe, Shigeru Taketani, Yoko Endo-Ichikawa, et al. Analysis of the candidate genes responsible for non-syndromic cleft lip and palate in Japanese people ［J］. Clinical Science,2000,99∶105-111

　　［3］  Andew C Lidral, Jefferey C Murray, Kenneth H.Buetow, et al. Studies of the candidate genes TGFB2,MSX1,TGFA and TGFB3 in the etiology of cleft lip and palate in the Philippines ［J］. Genetics,1996∶311-316

　　［4］  Field LL, Ray AK, Cooper ME, et al. Genome scan for loci involved in nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate in families from West Bengal, India ［J］. Am J Med Genet, 2004 ,130(3)∶265-71

　　［5］  Zeiger JS, Hetmanski JB, Beaty TH, et al. Evidence for linkage of nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate to a region on chromosome 2 ［J］. Eur J Hum Genet, 2003,11(11)∶835-839

　　［6］  Jezewski PA, Vieira AR, Nishimura C, et al. Complete sequencing shows a role for MSX1 in non-syndromic cleft lip and palate ［J］. J Med Genet, 2003, 40(6)∶399-407

　　基金项目  黑龙江省自然科学基金资助项目（编号：D0348）

　　作者简介  焦晓辉（1958~ ），男，哈尔滨市人，教授，主要从事口腔颌面外科学尤其是唇腭裂的临床、教学和科研工作。