人牙周韧带细胞和β-磷酸三钙多孔生物陶瓷的牙周组织工程研究

作者：张翼 王贻宁　赵艳 田敏 陈新民

【关键词】  组织工程化牙周膜

　　［摘要］  目的：以多孔β-磷酸三钙（β-TCP ）生物陶瓷材料作为组织工程支架，以人牙周韧带细胞（PDLCs）作为种子细胞，探索构建组织工程化牙周膜的可行性。方法：将体外培养7 d的PDLCs和β-TCP的复合物，植入裸鼠背部一侧皮下，在对称部位植入单纯的β-TCP作为空白对照。术后4周、8周、12周分别取材，进行组织学检测。结果：实验组8周后支架材料部分吸收，可见未降解的支架材料孔洞内广泛分布着新生组织，其内可见小血管、腺体等结构；12周时支架材料大部分吸收，取而代之的是大量片状的新生结缔组织。空白组组织形成较少，支架材料降解与实验组相似。结论：体外培养的PDLCs与β-TCP复合后，能在体内增殖、分化，形成结缔组织，从而证明以β-TCP作为支架材料进行的牙周组织工程是可行的。

　　［关键词］  组织工程化牙周膜  牙周韧带细胞  β-磷酸三钙

　　A Study of Tissue Engineered Periodontal Ligament Based on Human Periodontal Ligament Cells and β-TCP.

　　ZHANG Yi, WANG Yi-ning, ZHAO Yan, et al.

　　Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering (Wuhan University), Ministry of Education. Wuhan 430079

　　［Abstract］Objective: To investigate the possibility of generate tissue engineered periodontal ligament by using porous β-TCP as scaffold and human periodontal ligament（PDL） cells as seed cell. Methods: PDLCs were seeded onto scaffolds and implanted subcutaneously in  BALB/c-nu mice. The control group were implanted by β-TCP only. Formed tissues were harvested at 4,8,12 weeks after operation for histological analysis. Results: In the experimental group, histological analysis demonstrated obvious degradation of β-TCP and extensive new formation at 8 weeks after operation. The degradation of β-TCP was even obvious at 12 weeks after operation, and the cells on β-TCP formed sparse monolayers as well as the connected tissues. In the control group, only a small quantity of new formation could be seen. Conclusion: It is feasible to generate tissue engineered periodontal ligament by using porous β-TCP as scaffold and hPDLCs as seed cell.

　　［Key words］  Tissue engineering  Human periodontal ligament cells  β-tricalcium phosphate

    骨整合的概念由于其在理论和临床上所取得的巨大成功而获得共识，然而，相对于天然牙，骨整合种植体缺乏牙周韧带这一特殊结构，对受力和位移的感觉比较迟钝，种植体易受创伤。同时由于牙龈与种植体附着远比天然牙的附着脆弱，是界面上的一个薄弱环节［1］。因此，近年来种植体周牙周膜的构建一直是研究的热点。本实验室采取组织工程的概念构建种植体周牙周膜，将牙周韧带细胞作为牙周膜组织工程的种子细胞，以多孔β-TCP作为支架材料，进行体外三维立体培养后进行体内移植，探讨其作为支架材料构建组织工程化牙周膜的可能。

　　1  材料与方法

　　1.1  主要试剂和仪器  高糖DMEM和胰蛋白酶（Gibco，美国）；胎牛血清（Fetal bovine serum, FBS杭州四季清生物制品有限公司）；超净工作台（苏州净安泰空气技术有限公司）；全自动CO2孵箱（Precision，美国）；Olympus光学显微镜及照相系统（日本）。裸鼠购自武汉生物科学院实验动物中心。β-磷酸三钙（β-TCP ）由武汉理工大学生物材料中心提供。

　　1.2  人牙周韧带细胞的分离培养  选择临床上因正畸而拔除的无龋病、无牙周病的12~16岁青少年双尖牙，在无菌条件下刮取根中1/3处牙周膜，用组织块法进行原代培养。取第四代细胞进行实验。

　　1.3  β-TCP支架材料的预备  β-TCP由武汉理工大学提供，为10 mm×10 mm大小方片，厚1 mm，高温高压消毒灭菌，在24孔板中用含20%新生牛血清的DMEM培养基孵育过夜。

　　1.4  体外构建细胞-陶瓷支架复合体  将第四代人PDLCs接种到β-TCP支架材料上，形成两者复合体。步骤：将1 mL细胞悬液（7×106）接种到预备好的β-TCP支架上，在37 ℃、5%CO2培养箱中放置6 h，使细胞附着在支架材料上，随后加入含20%新生牛血清的DMEM培养基，体外培育7 d后，进行体内移植。

　　1.5  细胞-支架复合体的体内植入  取24只6周龄BALB/C-nu裸鼠（每只体重约18~20 g），随机分为3组，每组8只。常规麻醉下在背部一侧制备长约1 cm切口，钝性分离，将细胞-支架复合体植入皮下。在对称部位植入单纯的β-TCP，作为空白对照。

　　1.6  体内培育产物检测  植入后4、8、12周取材，经4%多聚甲醛4 ℃固定24 h、甲酸甲酸钠溶液脱钙48 h后，乙醇梯度脱水、透明、石蜡包埋及切片，HE染色，进行组织学检测。

　　2  结果

    两组动物均健康成活至实验结束，伤口愈合，无感染等并发症发生。术后实验侧和对照侧肉眼可见皮下植入物隆起的轮廓，边缘清晰。

    组织学结果显示：4周时，支架材料与周围组织间有结缔组织包裹，材料少量降解，实验组材料孔隙内可见大量细胞广泛分布，见图1，有少量淋巴细胞和浆细胞。材料边缘有小血管长入，但其中心未

　　图1 － 图3  略

　　图4 － 图6  略　

　　见血管。空白组细胞量明显较少，见图2。8周后，材料孔隙内细胞数量扩增，实验组细胞基质分泌明显增多。支架材料部分降解。实验组可见未降解的支架材料孔隙内广泛分布着小片状新生结缔组织，其内可见小血管、腺体等结构，见图3。空白组可见细胞向材料中心长入，细胞数量增多，见图4。12周时，细胞量进一步增大，支架材料大部分降解，取而代之的是大量片状的新生结缔组织，血管丰富，见图5。材料边缘与周围组织连续自然，无结缔组织包裹。空白组较实验组新生组织较少，见图6。

　　3  讨论

    组织工程发展的重要前提是适宜的支架材料和充足的种子细胞。牙周组织工程已成为牙周领域研究的重点和热点。在目前的研究中，组织工程化牙周膜的首选种子细胞是具有不定向分化潜能的牙周组织前体细胞--牙周韧带细胞。但对于适宜的支架材料的选择仍是研究的重点。牙周组织工程对支架材料的基本要求是具有良好的生物相容性，生物降解性及降解可调性；良好的骨诱导性和骨传导性：以及利于细胞黏附与增殖，易于塑性，易于消毒和保存［2］。现已报道用于牙周组织工程和牙周再生的支架材料范围极广，有人工合成的聚酯类材料，如EVA、PGA［3］、PLA等；HAP［4］、β-TCP、可溶性钙磷玻璃等生物活性材料；以及胶原蛋白等多种类型。

 目前将β-TCP作为组织工程的支架材料主要应用于骨和软骨的组织工程［5］，并已取得了肯定性进展。研究表明β-TCP具有骨和软骨组织生长的诱导能力［6］、良好的生物相容性和较高的机械强度，而且能根据需要调节材料在体内的降解时间，是一种很有潜力的支架材料。在牙及牙周的组织工程中，将β-TCP作为支架材料的研究也取得了一定的进展［7,8］。牙周韧带细胞具有向牙周成纤维细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞分化的潜能，在一定的诱导条件下，牙周韧带细胞能分化为成牙骨质细胞和成骨细胞［9］。β-TCP能促进PDLCs向成骨表型分化［10］。现有的研究证明PDLCs接种到β-TCP支架后，可大量增殖，并向成骨方向分化，碱性磷酸酶、骨钙素等检测结果明显增高［5］。在牙周组织再生的研究中，β-TCP作为支架材料不仅能促进牙周组织的再生，更能有效的诱导成骨细胞和成牙骨质细胞的增殖，具有良好的临床应用前景。这些研究为我们在种植体周利用β-TCP构建组织工程化牙周膜奠定了一定的基础。

    本实验选用β-TCP作为支架材料，研究结果表明β-TCP与PDLCs具有良好的生物安全性，能在裸鼠体内生长良好。随着植入时间的延长，β-TCP逐渐降解。由于降解后能形成部高浓度的钙、磷离子，有望促使PDLCs向成骨表型分化。空白对照组组织学观察表明，随着植入时间的延长，材料孔隙内的细胞量也明显增多，伴随大量组织新生，表明β-TCP具有良好的组织生长引导能力。而在实验组标本中该材料在体内与周围组织连续自然，有大量小血管渗入陶瓷材料孔隙，孔隙内可见标本中该材料在体内与周围组织连续自然，有大量小血管渗入陶瓷材料孔隙，孔隙内可见PDLCs生长。上述结果进一步表明β-TCP多孔陶瓷为PDLCs的生长和分化提供了理想的三维空间，并具备作为牙周组织工程支架材料的潜力。

    综上，β-TCP作为牙周组织工程支架，具有良好的生物相容性，良好的组织生长引导能力，为PDLCs的生长和分化提供了适合的空间，并具有引导PDLCs向成骨细胞转化的潜力，在组织工程化牙周膜的构建中有良好的应用前景。

　　参考文献

　　［1］  徐君伍.口腔修复理论与临床［M］.北京：人民卫生出版社，1999∶476-480

　　［2］  杨志明等.组织工程［M］.北京：化学工业出版社，2002∶325-327

　　［3］  王贻宁，赵艳.人牙周韧带细胞在聚羟基乙酸支架上体外三维培养的实验研究.口腔医学研究，2004，20（1）∶5-7

　　［4］  Lu H, Wu ZF, Tian Y. A study on the effects of cells and scaffolds tissue engineering on the periodontal regeneration. Zhong Hua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi, 2004,39(3)∶189-192

　　［5］  Galois L, Mainard D, Delagoutte JP. Beta-tricalcium phosphate ceramic as a bone substitute in orthopacdic surgery ［J］. Int Orthop,2002,26(2)∶109-115

　　［6］  Boo JS, Yamada Y, Okazaki Y，et al. Tissue-engineered bone using mesenchymal stem cells and a biodegradable scaffold ［J］. J Craniofac Surg, 2002, 13(2)∶231-9; discussion 240-3

　　［7］  Ueda M. Regeneration of tooth and periodontal tissue using tissue engineering concepts. Nippon Rinsho, 2003,61(3)∶439-447

　　［8］  刘平，王贻宁.人牙周韧带细胞与β-磷酸三钙多孔生物陶瓷三维培养的实验研究［J］.临床医学研究，2004，4∶198-200

　　［9］  McCulloh CA. Origins and functions of cells essential for periodontal repair: the role of fibroblasts in tissue homeostasis ［J］. Oral Dis,1995,1∶271-278

　　［10］  Kazuaki Matsumura, Hyon SH, Nakajima N, et al. Surface modification of poly(ethylene-co-vinyl alcohol):hydroxyapatite immobilization and control of periodontal ligament cells differentiation ［J］. Biomaterials, 2004, 25∶4 817-4 824

　　基金项目  国家自然科学基金资助项目（编号：30171021）

　　作者简介  张翼（1979~ ）女，湖北武汉人，硕士研究生，主要研究方向为种植体周牙周组织工程。