颞下颌关节紊乱病关节滑液β-糖苷酶活性检测与临床意义

【关键词】β-糖苷酶

　　［摘要］  目的：检测滑液中β-糖苷酶活性改变，探讨其在颞下颌关节紊乱病发病机制及诊断研究中的意义。方法：用Borooahs法，对正常及结构紊乱、骨关节病患者关节滑液中β-糖苷酶进行检测，并进行统计学处理。结果：正常及病变关节滑液均能检测出β-糖苷酶活性形式，滑液各β-糖苷酶活性在结构紊乱组与骨关节病组均明显高于正常组，且在骨关节病组均明显高于结构紊乱组。结论：滑液中β-糖苷酶活性改变反映颞下颌关节病变程度，可作为颞下颌关节紊乱病滑液诊断的标志物。

　　［关键词］  β-糖苷酶  颞下颌关节紊乱病  滑液

　　Clinical Significance of β-glycosidase Isoenzymes Activity Changes in Synovial Fluid of Patients with Temporomandibular Disorders.

　　LIU Jun-jie, MU Hong, LONG Xing.

　　Oral and Maxillofacial Surgery of Shandong Provincial Hospital, Jinan, Shandong, 250021

　　［Abstract］Objective: To detect the changes of β-glycosidases in temporomandibular joint(TMJ) synovial fluid(SF),and probe the role of β-glycosidases in the study of pathogenesis and diagnosis of temporomandibular disorders(TMD). Methods: The activities of β-glycosidases in TMJ SF were assayed following the method of Borooah with Hitachi spectrophotometer and substrates. The SF samples were obtained from 23 patients with TMJ internal derangement(ID), 12 with TMJ osteoarthritis(OA), and 13 with normal controls(N).SF was collected from the upper joint space after injecting 1ml of N.S. Results: The specific activity of N-acetyl-β-glucosaminidase increased significantly both with ID (P<0.01) and with OA (P<0.001) than with the controls, along with increases in the activity of N-acetyl-β-galactosaminidase (P<0.05 with ID and P<0.01 with OA) and in β-glucuronidase(P<0.05 both with ID and OA). The N-acetyl-β-glucosaminidase activity with OA was especially significantly higher(P<0.001) than with ID. Conclusion: These findings suggest that the activities of β-glycosidases in TMJ SF reflect the degree of TMD, and can be the potential diagnostic marker of TMD.

　　［Key words］  β-glycosidase  Temporomandibular disorders  Synovial fluid

    β-糖苷酶为细胞内主要的溶酶体酶，其主要参与TMJ滑液透明质酸以及细胞外基质硫酸软骨素等氨基多糖分子的水解，从而引起滑液正常生理功能降低以及软骨基质降解破坏，导致TMD的发生。本实验主要检测滑液β-糖苷酶（N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶，N-乙酰-β-氨基半乳糖苷酶和β-葡糖苷酸酶）的活性，并探讨其与TMD不同病理类型的关系。

　　1  材料与方法

　　1.1  病例收集及分组  所有样本均来自武汉大学口腔医院颞下颌关节专科门诊，患者发病后未经任何治疗，经临床专科、关节侧位片及关节造影检查［1］后分为2组，即结构紊乱病组和骨关节病组。另外，13 侧无症状TMJ为对照组，见表1。

　　表1  实验分组及各组情况　略

　　1.2  关节滑液的收集与处理  被检者耳前区消毒，耳颞神经局麻后嘱其张大口，在耳屏前1 cm外眦与耳屏连线下方约2 mm处穿刺，向上、前、内约30°角抵关节结节后斜面，回吸无血后注入1 mL生理盐水，反复注入回吸5次，待生理盐水与关节滑液混匀后回吸。4 000 r/min离心5 min，取上清夜-70 ℃冷冻保存备用。

　　1.3  滑液中β-糖苷酶活性及蛋白质浓度的测定  按照Borooahs法［2］，以对硝基苯酰-β-葡萄糖苷作为测定β-糖苷酶活性的底物，终止液为氢氧化钠-甘氨酸缓冲液，然后在410 nm波长用岛津UV-265型紫外可见光分光光度计对释放出来的对硝基酚进行检测,同时设标准及空白对照，记录各管吸光度值A，计算各酶活性。并用Lowrys法［3］对滑液中蛋白质浓度进行测定。酶活性单位定义以每分钟释放出1 nmol 对硝基苯酚作为一个酶活性单位，并将酶活性单位与滑液中蛋白质浓度相比，以比活反映酶的特殊活性（单位：unit/mg protein）。

　　1.4  统计学处理  β-糖苷酶活性测定结果以±s表示，分别应用SPSS统计分析软件对各实验组结果进行方差分析以及组间t检验，P<0.05差异具有显著性。

　　2  结果

　　2.1  各实验组滑液β-糖苷酶活性单位均数以±s表示，见表2。

　　表2  各实验组滑液β-糖苷酶活性单位（略）

　　2.2  各实验组之间TMJ滑液β-糖苷酶活性的比较  正常关节滑液中均检测到各β-糖苷酶活性，但较病变各组低，且滑液中各β-糖苷酶活性随着TMD的病变程度而增加，见图1~图3。滑液中N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性在ID组(P<0.01)与OA组(P<0.001)均明显高于正常对照组；N-乙酰-β-氨基半乳糖苷酶活性在ID组(P<0.05)与OA组(P<0.01)均明显高于正常组；β-葡糖苷酸酶活性在ID组(P<0.05)与OA组(P<0.05)亦均较正常组高。而且各酶活性在OA组均明显高于ID组，尤其N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性在OA组与ID组之间的差异极为显著(P<0.001)。

　　图1 － 图3  略

　　3  讨论

    TMJ滑液具有润滑关节表面、营养软骨细胞及清除细胞碎屑等功能［4，5］。TMD时滑液成分常发生一系列改变［6~8］，因而滑液检测分析对TMD的发病机制及诊断研究具有十分重要的意义。但TMJ滑液量很少，难以抽取，故我们将1ml生理盐水注入关节上腔稀释后获得滑液样本，并将检测到的酶活性单位与滑液中蛋白质含量相比，以比值反映β-糖苷酶特殊活性，这样可消除因滑液抽取所导致的稀释度不一致问题，并使各实验组之间具有可比性。

    β-糖苷酶（N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶，N-乙酰-β-氨基半乳糖苷酶和β-葡糖苷酸酶）是细胞内主要的酸性溶酶体水解酶，为外切糖苷酶，广泛存在于人体各组织及体液中。其分别作用于葡萄糖苷键、半乳糖苷键及葡萄糖醛酸甙的β-糖苷键以参与透明质酸、硫酸软骨素等氨基多糖的水解。我们研究发现正常关节滑液中均检测到N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶及其同工酶活性形式，但较病变各组低，且滑液中各β-糖苷酶活性随着TMD的病变程度而增加，在ID组与OA组均明显高于正常对照组，而且在OA组亦均明显高于ID组，尤其N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性在OA组与ID组以及OA组与正常对照组之间的差异极为显著(P<0.001)。因而可表明TMD时滑液透明质酸以及软骨基质的降解加速，这与Ishimaru和Kamada等［8，9］的分析结果一致，即TMJ骨关节病时滑液透明质酸数量及分子量均降低，而硫酸软骨素降解片段明显增加。透明质酸质和量的改变，使滑液功能异常，引起或加重关节疾病，而软骨基质破坏可直接导致TMJ骨关节病的发生。因此滑液β-糖苷酶活性检测对于TMD发生的早期诊断具有重要的临床意义。但β-糖苷酶活性随病变增加的原因不清，可能有以下原因：1）滑膜对血浆蛋白的通透性，因Orlacchi等［10］研究表明血浆中N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性明显高于TMJ滑液；2）滑膜细胞病变，溶酶体酶释放；3）TMJ组织病变时TGF β、TNF α、IL-1等细胞因子激活，使滑膜及软骨细胞内溶酶体代谢旺盛，诱发β-糖苷酶合成增加。4）TMD病变使滑膜组织对滑液β-糖苷酶的清除能力降低。

 目前，血或尿中N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶的检测分析已被广泛应用于临床评估肝、肾疾病或探测肾中毒［11］。而我们亦研究发现TMJ滑液N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶及其同工酶活性随TMJ的病理进程而显著增加，这在一定程度上可反映TMJ的病变程度，因此其可作为TMD时关节滑液诊断及预后的一种重要的标志物。

　　参考文献

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　　［2］  Borooah K, Leaback DH, Walker PG. Studies on glucosaminidase substrates for N-acetyl-β-glucosaminidase ［J］. Biochem J, 1961，78∶106-110

　　［3］  Lowry O, Rosebrough N, Farr A, et al. Protein measurement with the folin phenol reagent ［J］. J Biol Chem,1951，193∶265-275

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　　［7］  Srinivas R, Sorsa T, Tjaderhane L, et al. Matrix metalloproteinases in mild and severe temporomandibular joint internal derangement synovial fluid ［J］. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod,2001，91(5)∶517-525

　　［8］  Ishimaru JI, Ogi N, Mizuno S, et al. Quantitation of chondoitin-sulfates, disaccharides and hyaluronan in normal, early and advanced osteoarthritic sheep temporomandibular joints ［J］. Osteoarthritis Cartilage,2001，9(4)∶365-370

　　［9］  Kamada A, Kakudo K, Okazaki J, et al. Analysis of hyaluronic acid in temporomandibular joint synovial fluid ［J］. J Dent Res,1992，71∶590

　　［10］  Orlacchio A, Maffei C, Beccari T, et al. N-acetyl-β-D-glucosaminidase isoenzymes by chromatofocusing from serum and skin in diabetes ［J］. Clinica Chimica Acta,1984，141∶127-133

　　［11］  Price RG. Measurement of  N-acetyl-β-glucosaminidase and its isoenzymes in urine methods and clinical applications ［J］. Eur J Clin Chem Clin Biochem,1992，30∶693-705

　　作者简介  刘俊杰（1974~ ），男，住院医师，硕士研究生，主要研究方向为颞下颌关节紊乱病。