口腔鳞癌中Rb/cyclinD1/p16通路表达及其病理意义

作者：杨贤东 肖晶 朱恩新

 【关键词】  口腔鳞状细胞癌

　　［摘要］  目的：探讨口腔鳞癌（OSCC）中Rb/cyclinD1/p16通路表达及其病理意义。方法：使用免疫组化方法在37例OSCC标本中检测Rb、cyclinD1、p16蛋白表达，并与患者临床病理参数进行相关性分析。结果：Rb、p16、cyclinD1阳性表达率分别为76%、49%和57%；Rb和p16表达呈负相关（P=0.02）；cyclinD1表达与肿瘤大小（P=0.02）和淋巴结转移（P=0.01）呈正相关；p16表达与年龄呈负相关（P=0.02）。结论：1）OSCC中和Rb和p16之间可能存在的调控机制；2）p16缺失是OSCC发生中的早期事件；3）cyclinD1对肿瘤的生长作用大于对肿瘤的发生作用，与OSCC的增殖和淋巴结转移关系密切，并可能作为标志物对OSCC的预后和转移作出评估。

　　［关键词］  口腔鳞状细胞癌  Rb蛋白  p16蛋白  cyclinD1  免疫组织化学

　　Immunohistochemical Expression of Rb/cyclinD1/p16 Pathway Proteins in Oral Squamous Cell Carcinoma: Correlation with Clinicopathological Features.

　　YANG Xian-dong, XIAO Jing, ZHU En-xin.

　　School of Stomatology, Dalian Medical University, Dalian 116027

　　［Abstract］Objective: To investigate the prognostic value and clinicopathological correlation of tumor Rb, p16 and cycinD1 protein expression in patients with oral squamous cell carcinoma (OSCC). Methods: Immunohistochemical analysis was performed to examine tumor Rb, p16 and cycinD1 proteins level in 37 cases of OSCC, and Fisher' exact test was used to analyze the results with relevant clinicopathological factors. Results: Positive expression of Rb, cyclinD1 and p16 protein were observed in 28/37 (76%),18/37(49%) and 21/37(57%) cases of OSCC, respectively. An inverse correlation was found between p16 and Rb protein level expression statistically (P=0.02); cyclinD1 over-expression was associated with tumor size (P=0.02) and lymph node metastases (P=0.01); Diminished protein level of p16 was detected in the elderly group (over 60 years) as compared with the younger group (less than 60 years) (P=0.02). Conclusions: 1) The possible interaction between Rb and p16 plays a role in OSCC tumorigenesis, 2) Loss of the p16 protein expression may be the early event in the OSCC development, 3) Over-expression of cyclinD1 might be more correlated to tumor progression than to tumor initiation and critical in tumor cell proliferation and metastasis to lymph nodes. Furthermore, cyclinD1 may be a potential marker clinically as a predictor of lymph node metastases and guide therapeutic strategies in OSCC.

　　［Key words］  Oral squamous cell carcinoma(OSCC)  Rb protein  p16 protein  CyclinD1  Immunohistochemistry

    口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC)的发生发展是一个长时间的、多步骤、多阶段逐步演进的过程，存在多个遗传物质的异常。本研究使用免疫组化方法在OSCC中检测Rb、cyclinD1、p16等细胞周期调控因子的表达状况和相互间的联系，以及这些调控因子与OSCC病人临床病理学参数间的关系。比较和分析了这些因子在OSCC发生、发展、转移及预后中所起的作用及意义。

　　1  材料与方法

　　1.1  病例资料及标准  以大连医科大学附属第一医院口腔颌面外科1998~2000年手术切除的37例OSCC为研究材料。病例选择标准如下：1）首次手术或活检的病例；2）病理学诊断明确，临床病理及随诊资料充足真实。3）取材前无其他头颈部癌肿史。4）无放化疗史。其中男性24例，女性13例，平均年龄57.5岁。根据UICC（1997）标准的TNM分期和WHO的分化标准将肿瘤进一步分类：T1-T4分别为6例、7例、14例、10例。No期17例、N1期20例；高分化22例，中分化6例，低分化9例。按发生部位：颊6例，舌11例，唇7例，口底2例，牙龈

　　图1 － 图5  略

　　11例。标本经中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，5 μm切片。

　　1.2  试剂及方法  鼠抗人单克隆p16抗体（F12）（Santa Cruz CA）；鼠抗人单克隆Rb抗体（1F8）和鼠抗人单克隆cyclinD1抗体（DCS-6）（DAKO Denmark）。常规免疫组织化学ABC法染色，Rb、cyclinD1、p16抗体浓度分别为1∶40、1∶50、1∶200。一抗4 ℃湿盒过夜。二抗，三抗孵育分别为20 min、30 min，过氧化氢DAB液显色3 min。染色过程中PBS代替一抗作为所有染色的阴性对照，使用切片中非肿瘤上皮细胞、间叶细胞和炎细胞作为Rb和p16内在阳性对照，使用一例已知cyclinD1阳性的颊癌组织作为cyclinD1的阳性对照。

　　1.3  结果判定、计数及统计处理  Rb/cyclinD1/p16的免疫组化结果以细胞核呈棕色为阳性，细胞质呈淡棕色或细胞核不着色为阴性，。使用半定量法进行结果判定，每张切片选择10个典型的高倍视野（×40），计数至少1 000个细胞，根据阳性细胞核百分数进行分类，（-）：0~5%，（+）：5%~25%，（++）：25%~50%，（+++）：50%~75%，（++++）≥75%。Rb、p16、cyclinD1的免疫组化结果之间以及免疫组化结果和临床病理资料间关系均使用四格表精确概率法（Fisher法）进行统计分析。

　　2  结果

　　2.1  免疫组化结果  肿瘤组织中，Rb、p16、cyclinD1均表达于肿瘤细胞的细胞核内，Rb以癌巢周边表达密集、强烈，细胞核染色致密、均匀，接近癌巢中心部位表达少而弱，见图1、图2；p16均匀表达于癌巢中，核染色略浅于Rb，见图3、图4；cyclinD1在癌巢中呈散在、淡染的染色，见图5。在肿瘤间质中，Rb、p16散在的表达于血管壁和纤维细胞的细胞核内，cyclinD1在间质中未见表达。

　　2.2  免疫组化结果统计  Rb、cyclinD1、p16的免疫组化结果：37例OSCC患者中，Rb、p16表达缺失分别为9例（24%）和19例（51%），cyclinD1表达阳性为21例（57%），Rb和p16的表达呈负相关（P=0.02），Rb与cyclinD1，p16与cyclinD1间无相关性。

　2.3  免疫组化与临床病理资料之间的关系  Rb蛋白表达与临床病理资料之间无相关性，而cyclinD1表达与肿瘤大小（P=0.02）以及肿瘤颈淋巴结转移（P=0.01）关系密切，即出现颈淋巴结转移的鳞癌中cyclinD1的表达多于非颈淋巴结转移的鳞癌；直径大（T3，T4）的肿瘤组中cyclinD1的表达多于直径小（T1，T2）的肿瘤组；此外p16蛋白在高龄组（≥60岁）表达比在低龄组（<60岁）中表达少（P=0.02）。

　　3  讨论

    在细胞周期调控中，G1→S期间调控点是细胞内外信号传递，整合汇集到细胞核，对细胞的增殖进行调控的关键点，该点调控的异常与肿瘤的发生发展关系密切。与之相关的Rb、cyclinD1、p16等共同组成一条重要的细胞调节通路，Rb蛋白在G1期→S期中起关键作用。非磷酸化的Rb蛋白可结合到转录因子E2F DNA复合物上，在启动子上阻断mRNA的转录，磷酸化的Rb蛋白则无此活性。在G1期，cyclinD1与CDK4形成的复合物具有激酶活性，促进Rb蛋白磷酸化，而p16与cyclinD1竞争结合CDK4，抑制Rb磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期。因此，Rb、cyclinD1、p16形成一个反馈调节环路［1］。

    本项对37例OSCC的研究中Rb蛋白表达28例（76%），p16蛋白表达18例（49%），cyclinD1表达率为21例（57%）。将三者结果结合分析表明除5例（14%）外，其余32例（86%）中至少有一种蛋白表达异常，提示Rb/cyclinD1/p16通路中任何一个因素失调都可能中断该通路，最终导致肿瘤的发生，可见该通路在OSCC发生中的重要作用。

    以往发现Rb和p16表达负相关关系的报道，均认为是Rb失活刺激p16表达的一种负反馈机制［2］。使用免疫组化法可以显示单个细胞中蛋白的表达情况，而且通过观察切片可以反复检查每种蛋白的表达情况，但是免疫组化无法分辨磷酸化（非功能状态）和非磷酸化（功能状态）的Rb蛋白，即Rb组化阳性组织中，可能存在着磷酸化的、非功能状态的Rb蛋白。同样，免疫组化法只能分辨p16基因缺失和5’端甲基化的蛋白产物，却无法区分p16基因点突变的蛋白产物，不过由于p16基因失活机制中点突变发生的频率最低［3］，由此推测：实验结果中Rb蛋白高水平表达、p16低水平表达的原因可能是p16的失活使Rb蛋白处于过磷酸化的失活状态并且堆积在细胞中，此结论与以前学者的观点是完全不同的。

    以往对人类实体瘤的研究中，极少有p16表达与年龄存在负相关的报道。正常细胞中p16只能在出生后检测到，它与cyclinD1一起随着年龄增长而逐渐增多，两者在细胞中不断竞争，而积累下来。当细胞中DNA受低水平损伤时，随着应激反应积累，细胞内p16增多，使细胞停止于G1期，进行修复。若损伤积累到一定程度，p16使细胞进入凋亡途径［4］。但是包括OSCC在内，发生p16失活的许多肿瘤，患者长期暴露于致癌物中，致癌物使p16逐渐发生遗传和非遗传上的改变，这些改变又是随着年龄的增长而发生，并积累下来，使细胞进入无调控的增殖周期，最终导致肿瘤发生。作炎抑癌基因，p16的作用是长期缓慢的，结合本实验p16与年龄表达负相关的结果，提示p16可能在肿瘤发生早期即出现改变。此结论与近期发表的、使用不同方法、并在其他部位肿瘤的研究结果一致［5，6］。

    本实验发现cyclinD1表达与颈淋巴结转移呈正相关（P=0.01），而且与肿瘤大小也存在正相关关系（P=0.02）。只有极少的研究指出，cyclinD1的表达与淋巴结转移有关。Takes等［7］报导在食管癌中cyclinD1的表达与颈淋巴结转移存在相关性，但是无显著性差异。cyclinD1在体积大的肿瘤组（直径≥4 cm，T3、T4）比在体积小的肿瘤组（直径<4 cm，T1、T2）中表达多（P=0.02）。但未发现cyclinD1与肿瘤分化程度等有关。由此推测：1）cyclinD1在肿瘤生长中的作用，要大于在肿瘤发生中的作用；2）cyclinD1异常表达的肿瘤细胞可能具有更强的增殖和淋巴结转移能力。3）在活检诊断中cyclinD1的表达可以作为评估肿瘤颈淋巴结转移的标志物，并可能成为选择颈淋巴结清扫术的参考依据。但是从实际应用角度来看，cyclinD1免疫组化阳性的细胞中可能包括异质性的cyclinD1基因产物部分，这部分的cyclinD1蛋白无法通过免疫组化方法鉴别出来。

    综上所述，本实验动用免疫组化方法，进一步证实了Rb/cyclinD1/p16通路在OSCC发生中的重要作用，证实了p16表达缺失是OSCC发生中的早期事件，推测Rb和p16在OSCC发表发展中可能存在的调节机制，cyclinD1可能作为肿瘤标志物对OSCC颈淋巴结转移和预后评价有重要参考价值。

　　参考文献

　　［1］  Hashiguchi Y, Tsuda H, Inoue T, et al. Alteration of cell cycle regulators correlates with survival in epithelial ovarian cancer patients ［J］. Hum Pathol, 2004, 35(2)∶165-175

　　［2］  刘树泰,高文信,魏秀峰,等.P27、p16和pRb蛋白在金黄地鼠颊囊癌变过程中的表达及意义［J］.口腔医学研究,2003,19(6)∶457-460

　　［3］  Sun Y, Hildesheim A, Lanier AE, et al. No point mutation but decreased expression of the p16/MTS1 tumor suppressor gene in neopharyngeal carcinomas ［J］. Oncogene, 1995,10(4)∶785-788

　　［4］  Robles SJ, Adami GR. Agents that cause DNA double strand breaks lead to p16INK4a enrichment and the premature senescence of normal fibroblasts ［J］. Oncogene, 1998,16(9)∶1 113-1 123

　　［5］  Al-Aynati MM, Radulovich N, Ho J, et al. Overexpression of G1-S Cyclins and Cyclin-Dependent kinases during Multistage Human Pancreatic Duct Cell Carcinogenesis ［J］. Clin Cancer Res, 2004,10(19)∶6 598-6 605

　　［6］  Volgareva G, Zavalishina L, Andreeva Y, et al. Protein p16 as a marker of dysplastic and neoplastic alteration in cervecal epithelial cells ［J］. BCM Cancer, 2004,4(1)∶58

　　［7］  Takes RP, Baatenburg RJ, Schuuring E, et al. Markers for assessment of nodal metastasis in laryngeal carcinoma ［J］. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1997,123(4)∶412-419

　　作者简介  杨贤东（1977~ ），男，辽宁人，助教，硕士，主要从事口腔病理学临床及基础研究工作。