MTAP对人乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，占女性肿瘤发病的首位。乳腺癌是一种基因学上异质性的疾病，而这些基因的异常又决定着肿瘤的特性.因此，发现决定乳腺癌发生与进展的关键基因具有重要的现实意义。甲硫腺营磷酸化酶(Meth少hioadenosine phosphorylase,MT AP)是一个看家基因，是甲硫氮酸和嗓吟合成补救途径的重要酶蛋白。它参与细胞的能量、DNA和蛋白质的合成，在细胞正常生理生化活动中有非常重要的作用。研究表明，MTAP在多种类型肿瘤中有不程度的表达下调·1-3)但是,MT}P对乳腺癌细胞生物学行为的影响及相关机制尚不清楚，故我们对此进行了初步研究探讨

1材料与方法

1.1人乳腺癌细胞系MCF-7细胞MCF-7细胞由中科院上海细胞库提供，培养于高糖改良杜氏伊格尔完全培养基(Dulbecco's modified eagle medium,DMEM)中(含10%胎牛血清，青霉素和链霉素各50 U/mL)，实验分组:空白对照组、阴性对照组、MATP-siRNA实验组。相同条件下实验重复3次以上。

1.2 Western blotting检测MCF-7细胞接种于6孔板，收集细胞，常规裂解提取蛋白。蛋白经十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SD斗上样缓冲液煮沸变性3 min，经聚丙烯酞胺凝胶电泳分离蛋白;100 V恒压转膜2 h,5%脱脂牛奶封闭1h;一抗4℃孵育过夜，Tris盐加土温缓冲液(Tris Buffered Saline,with Tween-20,'I'PS'1)洗膜3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h,TPST洗膜3次，化学发光法显色MTAP抗体(SC17015)、基质金属蛋白酶(Matrix tnetalloproteinase 1,MMPl)抗体(SC58377)和二抗为美国Santa cruz公司产品。

1.3 siRNA干扰将3 x 105个MCF-7细胞接种于6孔板，更换无血清培养基，1.5 mL/孔。配置转染复合物:A:用250},L Opti-MEM培养基稀释siRl1'A(转染细胞的终浓度为50 nM)，轻柔颠倒混合均匀;B:用250}.},L Opti-MEM稀释5 p,,I.Lipofectamine「2000(invitrogen)转染试剂，轻柔混合均匀，在室温下静置5 min;C:将B液缓慢滴加人,A液内，轻柔混匀，在常温下反应20 min;将转染复合物滴人到6孔细胞板中至2 mL/孔，细胞板置于培养箱中培养6h后更换新鲜完全培养基。

1.4 CCK-8检测MCF-7细胞的增生将对数生长期的MCF-7细胞接种于%孔板中，每孔0.5/IO'个，再加人200 p,L I)MEM完全培养基。分别在培养细胞24 h,48玩72 h后更换培养基，句孔加人10 p,L CCK-8溶液，孵育2 h}〕用酶标仪测定450 nm吸光度值(人so)统计计算数据。

1.5 MCF-7细胞侵袭能力检测制备对数生长期的MCF-7细胞悬液，细胞密度为3x105个/mL，取400 p,L接种在已铺有基质胶ECM的Transwell小室的匕腔中，下腔中加人600 p,L含10%胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)的DMEM完全培养基。24 h后取出小室，无水乙醇固定20 min，苏木精一伊红染色20 min磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline,PBS)洗净后自然风干小室，显微镜下观察、计数。每孔加人10%醋酸150 p,L抽提细胞，酶标仪上检测570 nm吸光度值(态}o。1.6 MCF-7细胞迁移能力检测制备无血清培养基细胞悬液，调整细胞浓度为lx 106/mL，加loo时.细胞悬液到将未铺ECM基质胶的Tr-answell小室的卜室，加600},L含10%F'BS的DME}I培养基到小室的下室中孵育8h，将小室浸泡于染色液中20 nun，染色位于膜下表面的迁移细胞，PBS漂洗3次，晾干，显微镜下观察，每孔加人10%醋酸150},L抽提细胞，酶标仪仁检测570 nm吸光度值。

1.7统计学方法应用SPSS 15.0进行统计分析。计量数据用(均数士标准差)表示，组间比较采用单因素方差分析和均数两两比较I,}SD检验。P<0.05为差异有统计一学意义。

2结果

2.1 RNA干扰后MCF-7细胞中MTAP蛋白的检测VICF'-7细胞共分3组，空白对照组、阴性对照组、!VL}'I'P-siRN:}实验组。应用NIs1'I7〕一*ilz}A转染实验组I}ICF-7细胞，下调实验组细胞中M'I'.}l，的表达，}升胜对照组转染阴性对照siRNA，空白对照组不转染任何sih1}A Western blotting检测证实M'I'AP在vIATP-si1}}1A实验组的表达较对照组明显下调M'I'AI'抑制率为75.1%(图1)

2.2下调MTAP的表达促进MCF-7的增生利用CCI}-8试剂盒检测MCF-7细胞的增生〔.MCF-7细胞在转染MTAP-siRNA 24 h,48 h,72 h后，更换培养基后每孔加人10}L CCK-8溶液，孵育2 h,用酶标仪测定450 nm吸光度。计算MTAR siRNA实验组与空白对照组吸光度百分比(实验组吸光度值/对照组吸光度值x 100 070)。转染M'I'AP-siRNA后不同时间(24 h,48 h,72 h)的吸光度分别是空白对照组的(2.3士11.9)%、(144.4士8.4)%、(169.3士9.4)%,0167.6士9.3)0}0(图2)。以上结果表明下调MTAP的表达促进了MCF-7细胞的增生

2.3下调MTAP的表达促进MCF-7细胞的侵袭Transwel l侵袭实验结果显示，空白对照组、阴性对照组及MTAP-siR}A实验组570 nm吸光度值分另}J为0.49士0.06,0.45士0.07和0.87士0.07(P<0.O1)，MTAP-siRNA组细胞侵袭能力较空白对照组增强(图3)。

2.4下调MTAP的表达促进MCF-7细胞的迁移Transwell细胞迁移实验结果显示，空白对照组、阴性对照组及IVITAP-siRN A组570 nm吸光度值分别为0.46士0.06,0.49士0.08,0.75士0.07(尸<0.OS)，M'1'AP-siRNA组细胞迁移能力较空白对照组增强(图4),

2.5下调MTAP对MCF-7细胞中MMPl表达的影响利用siRNA干扰技术下调MCF-7细胞中MTAP的表达后，Western blotting检测发现MTAP-siRN组MMP1的表达较空自对照组上调(3.87士0.43)倍，表明MMPI在M'1'_1F'-siRN A实验组细胞中表达相应卜调(图5)。

3讨论

MTAP作为一种抑癌基因在多种类型肿瘤中都有不程度的表达下调，MTAP的表达与细胞的恶性转化密切相关。研究发现，黑色素瘤细胞内出现了MTAP基因的缺失，并导致MTA4倍浓度的积聚，进而MTA诱导肿瘤细胞侵袭力增强a。有研究通过比较基因组杂交发现，胃肠道间质瘤中出现了MTAP的纯合性缺失，并且这种缺失与肿瘤的大小、肿瘤细胞的有丝分裂速度、Ki-67指数、危险水平均呈正相关。MTAP的上述生物学特点提示其可能参与细胞的增生以及肿瘤的浸润和转移等，近来被认为是新的肿瘤诊断和治疗的分子靶点侵袭和转移是恶性肿瘤最显著的生物学特性，肿瘤细胞的侵袭和转移过程涉及到多个阶段和环节，其中最为重要的是对细胞外基质的降解而使肿瘤细胞的侵袭能力和迁移运动能力增强。本研究应用RNA干扰技术下调MCF-7乳腺癌细胞中MTAP的表达。利用CCK-8试剂盒检测MTAP下调后对MCF-7细胞增生的影响，发现在下调MTAP表达后，MCF-7细胞的增生能力明显增强。实验中，我们利用Transwell检测了MCF-7细胞的侵袭及迁移能力，结果发现，MCF-7细胞在MTAP下调后，侵袭及迁移能力也明显增强。因此我们推测MTAP与乳腺癌的恶性程度可能有密切关系，其表达下调对乳腺癌的恶性发展可能会有促进作用。细胞外基质及基底膜的降解是肿瘤浸润和转移的重要原因，基质金属蛋白酶是调节许多病理生理过程中细胞外基质和基底膜有序降解和重塑的重要分子。本研究发现，在下调MCF-7细胞中MTAP的表达后，MMP1的表达也相应上调，这提示MTAP对MCF-7细胞侵袭、迁移能力的影响可能也与MMP1有关总之，MTAP表达的缺失可以明显增加MCF-7乳腺癌细胞的侵袭及迁移能力，这提示MT}P的表达下调可能促进乳腺癌的侵袭和转移，MA'TP可能是一种乳腺癌中潜在的抑癌基因，但其确切机制仍有待进一步阐明

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