瑞舒伐他汀钙对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化血清抵抗素的影响

　　作者：李晓燕　杨国良　刘科卫　李爱国　张红明　韩淑芳　 作者单位：250031　济南军区总医院心内科

　　【摘要】 目的　研究瑞舒伐他汀钙对小鼠动脉粥样硬化血清抵抗素的影响。方法　将高脂喂养的雄性apoE-/-小鼠24只，随机分为模型组(n=12)、瑞舒伐他汀钙组(n=12，加用瑞舒伐他汀10 mg? kg-1?d-1蒸馏水稀释后灌胃)。雄性C57BL/6J野生型小鼠12只作为正常对照组。12周后，处死小鼠，收集血清，测定血脂及抵抗素的含量。取主动脉根部做病理切片，HE染色后，检测校正斑块面积。结果　瑞舒伐他汀钙组较模型组血中TC、TG、LDL-C浓度有显著下降(P<0.01)。瑞舒伐他汀钙组动脉粥样硬化病变的校正斑块面积显著低于模型组(P<0.01)。模型组与正常对照组比较，血清抵抗素浓度明显升高(P<0.01)。瑞舒伐他汀钙组较模型组血清抵抗素浓度显著降低(P<0.01)。结论　瑞舒伐他汀钙可有效地降低动脉粥样硬化小鼠的血清抵抗素含量，显著抑制炎症反应，抑制粥样斑块进展，从而减轻动脉粥样硬化，此可能为他汀类药物抗动脉粥样硬化的机制之一。

　　【关键词】 动脉粥样硬化,抵抗素,瑞舒伐他汀钙

　　【Abstract】　Objective　To investigate the effect of rosuvastatin on serum resistin in atherosclerosis of apoE-/- mice. Methods　Twenty-four four weeks old apoE-/- mice fed with high fat were divided randomly into two groups：model group，rosuvastatin calcium group.Meanwhile，take 12 healthy mice(C57BL/6 mice)with the same age and same genetic background to the normal group. Twelve weeks later，mice were anesthetized.Serum was saved. Concentrations of serum lipids(TC，TG，LDL and HDL)were measured by Biochemistry Analyzer.The excised aortic roots were examined for detailed histological analysis. Paraffin sections from the aortic root were stained with Hematoxylin and Eosin.The size of atherosclerotic lesion in each section was evaluated.Concentrations of resistin in serum were measured by ELISA. Results　Plasm TC，TG and LDL were lower in rosuvastatin calcium group than those in model group(P<0.01). The plaque areas of rosuvastatin calcium group were obviously smaller than that of model group(P<0.01). The level of resistin in serum was elevated in model group compared to those with the normal group(P<0.01).The level of resistin in serum was decreased in rosuvastatin calcium group compared to those with model group(P<0.01). Conclusions　Rosuvastatin calcium could significantly decrease the level of resistin in serum，inhibit inflammatory and inhibit the progression of atherosclerosis.Rosuvastatin could intervene with experimental atherosclerotic development in mice，which mechanism might be that rosuvastatin could suppress lipid，and it could rosuvastatin calcium could significantly decrease the level of resistin in serum.

　　【Key words】　Atherosclerosis;　Resistin;　Rosuvastatin

　　2001年，Steppan等[1]研究发现了一种由脂肪细胞分泌的肽类激素，它可以影响与胰岛素作用相关的葡萄糖代谢以及脂代谢，因而具有对抗胰岛素的功能而被命名为抵抗素(resistin)。抵抗素是存在于血浆中的富含半胱氨酸的分泌性蛋白，属于抵抗素样分子，又称FIZZs(found in inflammatory zone)家族成员[1]。有研究表明，抵抗素可作用于血管内皮细胞以及平滑肌细胞影响细胞功能，提示抵抗素可能参与血管病变[2]。本研究应用他汀类药物瑞舒伐他汀钙(rosuvastatin calcium)对小鼠动脉粥样硬化(AS)中血清抵抗素的影响，探讨他汀类药物抗AS的非调脂抗炎机制。

　　材料与方法

　　一、实验材料

　　4周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠12只，20～40 g;4周龄雄性apoE-/-小鼠(C57BL/6J背景)24只，20～40 g，均由北京大学医学部实验动物中心提供。瑞舒伐他汀钙选用可定，英国阿斯利康制药有限公司生产;10 mg/片，每盒7片;批号H20060406。抵抗素ELLISA试剂盒 (上海蓝基生物科技有限公司)。

　　二、模型的建立与分组

　　高脂饲料(0.15%胆固醇、21%脂肪，其余为普通饲料)喂养的4周龄雄性apoE-/-小鼠24只，随机分为2组：(1)模型组;(2)瑞舒伐他汀钙组：模型组喂养基础上加用瑞舒伐他汀钙10 mg? kg-1?d-1蒸馏水稀释后灌胃。4周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠12只作正常对照组。西方类型膳食连续喂养8周后从模型组apoE-/-小鼠中随机抽取2只，麻醉后处死，在无菌条件下取出主动脉，常规脱水，石蜡包埋并切片，苏木素-伊红(HE)染色以观察AS程度，确定造模是否成功。以镜下见到血管内膜增生和明显的脂质条纹突起作为动物模型制备成功的标志。第8周开始给予瑞舒伐他汀钙药物干预，正常组和模型组予以等量蒸馏水灌胃。

　　三、血脂测定

　　于喂养12周末小鼠禁食禁水一夜，腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)，麻醉后采用眼球摘除取血法，每只小鼠取血≥0.8 ml。血样静置2 h后高速离心(3000 r/min)，分离上层血清用于血清脂质及IFN-γ、IL-10的含量测定。使用酶比色法检测血清TC、TG，使用直接测定法检测HDL-C、LDL-C。

　　四、血清抵抗素的含量测定

　　采用ELISA法进行检测。具体步骤如下：(1)取出酶标板，依照次序分别加入100 μl的标准品于空白微孔中。(2)分别标记样品编号，加入100 μl样品于空白微孔中。(3)在标准品孔和样品孔中加入50 μl的酶标记溶液。(4)(36±2)℃孵育反应60 min。(5)洗板机清洗5次，每次静置10～20 s。(6)每孔加入底物A、B液各50 μl。(7)(36±2)℃下避光孵育反应15 min。(8)每孔加入50 μl终止液，终止反应。(9)应用酶标仪在450 nm测定光密度(OD)值。(10)以OD值作为纵坐标，以标准品的浓度值作为横坐标，从而绘制出标准曲线。在坐标上根据样品OD值找出相对应的浓度值。

　　五、主动脉根部组织学观察及AS面积检测

　　应用显微镜数码相机系统DP10观察HE染色切片，用Leica Qwin Image Processing and Analysis软件对切片上显示的AS斑块面积进行分析。常规石蜡包埋，连续切片30张，每隔5张取1张，行HE染色，算出平均值进行分析，测量斑块面积(PA)、血管管腔面积(LA)，计算校正斑块面积(PA/LA)，并用百分比(%)表示。

　　六、统计学处理

　　应用SPSS 18.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x-±s)表示。两组间比较采用t检验，两组以上的数据比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

　　结　果

　　1. 各组动物血脂水平的比较：如表1所示，模型组与正常对照组比较，血中TC、LDL-C浓度均明显升高(P<0.01)，血TG浓度也升高(P<0.05)。瑞舒伐他汀钙组较模型组血中TC显著下降(P<0.01);TG、LDL-C浓度有不同程度的下降 (P<0.05)。表1　各组动物血脂水平的比较

　　2. 主动脉粥样硬化病变形态学的检测结果：正常组：主动脉壁薄厚均匀，各层结构完整清晰，内膜光滑、中膜平滑肌细胞排列整齐，未见动脉粥样斑块形成。模型组：主动脉根部可以看到明显的动脉粥样斑块形成，由大量泡沫细胞堆积及胆固醇结晶构成。瑞舒伐他汀钙组：主动脉壁粥样斑块病变较小，脂质核心小，可见由少量泡沫细胞形成，病变程度比模型组明显减轻。

　　3. 主动脉粥样硬化病变PA/LA的比较：如表2所示，瑞舒伐他汀钙组PA/LA显著低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)。表2　两组apoE-/-小鼠PA/LA的比较

　　4. 血清抵抗素含量比较：如表3所示，模型组与正常对照组比较，血清抵抗素浓度明显升高(P<0.01)。瑞舒伐他汀钙组较模型组血清抵抗素浓度降低(P<0.01)。　表3　各组小鼠血清抵抗素含量比较组别,鼠数,抵抗素

　　讨　　论

　　Ross[3]在1999年研究提出损伤-反应学说，得到国内外众多学者的认可。后来Ross明确提出了AS是一种“慢性炎症性疾病”，涉及的细胞有炎症细胞(主要是单核/巨噬细胞)、血管内皮细胞以及平滑肌细胞;涉及的分子主要有黏附分子(包括细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1等)、趋化蛋白(如单核细胞趋化蛋白-1)以及各种细胞因子、生长因子等。近来多项研究发现抵抗素与AS相关，并参与了AS的发生发展。抵抗素含量与炎症因子的含量呈现正相关，而且被一致认为炎症的过程中存在着高抵抗素水平[4]。微阵列分析C57BL/6J apoE-/-小鼠主动脉，抵抗素表达水平同其他多种致AS因子一样显著增加，且抵抗素的mRNA水平随AS斑块面积的增加而增加，血清抵抗素水平同样升高。Bumett等[5]的研究发现AS患者和动物模型中的血浆抵抗素水平与正常者相比明显增高，在动物和人的AS斑块中均有抵抗素蛋白表达，在小鼠AS发展过程中，其大动脉抵抗素mRNA表达也随之增高。抵抗素可能经核因子-κB 途径使黏附分子的表达增加，促进单核细胞与内皮细胞的黏附，从而引起内皮功能的损伤。在Kawanami等[6]的研究中，采用30 nm/人重组抵抗素诱导人主动脉的内皮细胞，结果出现细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子的表达增加，促使单核-内皮细胞的黏附，且呈现剂量-反应的关系。在体外实验中发现，人抵抗素在外周血单核细胞中表达，在单核细胞分化获得巨噬细胞表型时，其mRNA水平较分化前增加了4倍[7]。Jung等[8]的研究中发现抵抗素可增强血管平滑肌细胞的迁移能力，且呈现剂量-效应关系，而平滑肌迁移能力的增加与AS病变的发展有密切的关系。

　　目前他汀类药物是临床应用最为广泛的调脂药物。研究发现他汀类药物可防治AS，具有改善血管内皮功能、抗炎和调节免疫、抗氧化、抑制平滑肌细胞增殖和迁移、抑制血栓形成以及稳定AS斑块等作用[9]。瑞舒伐他汀是一个氨基嘧啶衍生物，是全合成单一对映异构体化合物，2003年 8月获 FDA批准，是进入市场的第7种他汀类药物。与同类药物比较，瑞舒伐他汀对肝脏羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的竞争性抑制作用和降脂作用都较强;肝选择性更好，耐受性良好，不良反应发生率与同类药物相似。STELLAR 研究结果显示，瑞舒伐他汀(10～40 mg/d)可使血清 LDL-C 水平降低55%～65%，HDL-C 水平升高 13%[10]。而最新METEOR的研究显示：积极的他汀类药物治疗，可中止亚临床AS低危患者疾病的发展[11]。

　　本研究结果显示，瑞舒伐他汀钙可明显降低AS小鼠的血脂水平，特别是在降低血清胆固醇方面作用更强，表明瑞舒伐他汀具有较强的降脂作用。瑞舒伐他汀钙组小鼠的AS病变面积与模型组比较明显减小，说明瑞舒伐他汀钙可产生抗AS作用，减少了动脉粥样斑块形成。模型组血清抵抗素含量明显高于正常对照组，差异有统计学意义，提示抵抗素在AS的发病过程中起着重要的作用。瑞舒伐他汀钙干预组与模型组相比血清抵抗素含量明显减少，差异有统计学意义。总之，本研究发现，瑞舒伐他汀治疗可有效地降低血清抵抗素含量，有较强的抗炎作用，减轻粥样斑块的形成，此可能为他汀类药物抗AS的机制之一。

　　【参考文献】

　　[1]　Steppan CM，Bailey ST，Bhat S，et al.The hormone resistin links obesity to diabetes.Nature,2001,409(6818)：307-312.

　　[2]　Calabro P，Samudio I，Willerson JT，et al.Resistin promotes smooth muscle cell proliferation through activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and phosphatidylinositol 3-kinase pathways.Circulation,2004,110(21)：3335-3340.

　　[3]　Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease.J Med,1999,340：115-126.

　　[4]　Lehrke M，Reilly MP，Millington SC，et al.An inflammatory cascade leading to hyperresistinemia in humans.PloS Med,2004,1(2)：e45.

　　[5]　Bumett MS，Lee CW，Kinnaird TD，et al.The potential role of resistin in atherogenesis.Atherosclerosis,2005,182(2)：241-248.

　　[6]　Kawanami D，Maemura K，Takeda N，et al.Direct reciprocal efects of resistin and adiponectin on vascular endothelial cells：a new insight into adipo cytokine-endothelial cell interactions.Biochem Biophys Res Commun,2004,314(2)：415-419.

　　[7]　Patel L，Buckels AC，Kinghorn IJ，et al.Resistin is expressed in human macmphages and directly regulated by PPARgamma activators.Biochem Biophys Res Commun,2003,300(2)：472-476.

　　[8]　Jung HS，Park KH，Cho YM，et al.Resistin is secreted from macrophages in atheromas and promotes atherosclerosis.Cardiovasc Res,2006,69(1)：76-85.

　　[9]　Whitman SC，Ravisankar P，Daugherty A.IFN-gamma deficiency exerts gender-s pecific effects on atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice.J Interferon Cytokine Res,2002,22(6)：661-670.

　　[10]　Jones PH，Davidson MH，Stein EA，et al.Comparison of the efficacy and safety of rosuvastatin versus atorvastatin，simvastatin，and pravastatin across doses (STELLAR Trial).Am J Cardiol,2003,92(2)：152-160.

　　[11]　Nissen SE，Nicholls SJ，Sipahi I，et al.Effect of very high-intensity statin therapy on regression of coronary atherosclerosis：the ASTEROID trial.JAMA,2006,295(13)：1556-1565.