自然流产患者封闭抗体检测及免疫治疗临床研究

自然流产是妊娠常见的并发症，占妊娠总数的15% 左右[1]，其中2次或2次以上自然流产即复发性流产(RSA)，其发病率约为5%。RSA 病因比较复杂，排除遗传、解剖、内分泌、感染等因素后，仍有40% ～80% 的病例发病原因不明，称为不明原因性流产(UHA)[2]。目前认为免疫因素尤为重要。在免疫因素UHA 中约有30% 与自身抗体产生有关，称为自身免疫性RSA;另外约有70% 可能与患者对胎儿父系抗原低反应性有关，主要是由于患者对胚胎同种异体抗原无法产生足够的BA 有关，称为同种免疫性RSA。封闭抗体(BA)是人类白细胞抗原(HLA)、滋养层及淋巴细胞交叉反应抗原等刺激母体免疫系统，所产生的一类IgG 型抗体[3]。目前临床上多采用配偶或无关个体的淋巴细胞进行免疫治疗，诱导母体产生同种免疫反应，从而出现BA 及微淋巴细胞毒抗体，使母体免疫系统不易对胎儿产生免疫攻击，使妊娠继续，且治疗后，患者体内BA 的出现与成功受孕之间有良好的相关性。此方法的疗效，近年来多数报道认为有效[4]，有效率为70% ～90%，且未见主动免疫治疗对母体及后代产生明显的副反应。本研究采用配偶(或第三方)淋巴细胞皮下注射法对RSA 患者进行免疫治疗，并观察治疗前后BA 水平的变化与妊娠结果的关系，现报道如下。

1　资料与方法

1.1　一般资料　选择2009 年3 月至2011 年12 月到佛山市南海人民医院门诊就诊的有过1次以上流产史的患者，对所有研究对象进行妇产科检查、B 超或宫腔镜检查、染色体核型分析、TORCH 检查、性激素与甲状腺功能等内分泌检查，以及不孕相关的免疫学检验，包括抗心磷脂抗体、抗精子抗体、抗子宫内膜抗体及封闭抗体。

1.2　方法

1.2.1　健康宣教　采用宣传单、现场咨询等多种形式向就诊患者宣传RSA 的病因与治疗对策，说明“主动免疫”的意义、注意事项及方法等，指导患者配合治疗。建立RSA 治疗专项病历，记录治疗时间、辅助检查结果，定期电话随访，增强心理安慰与疏导。1.2.2　免疫治疗　用丈夫(首选)或第三方男性(首先要排除乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒及艾滋病等血源性传染性疾病)静脉血作为淋巴细胞免疫原供体，以淋巴细胞分离液分离供体淋巴细胞，选择自然流产患者前臂行8点皮下免疫注射。具体方法如下：无菌条件下取20mL 淋巴细胞分离液(由上海华精生物高科技公司提供)，置于离心管，加入20 mL 丈夫或第三方肝素抗凝静脉血于分离液层上。3000r/min离心30 min，小心 ·156· 国际检验医学杂志2013年1月第34卷第2期　IntJLabMed，January2013，Vol.34，No.2吸出淋巴细胞液层，20倍生理盐水洗涤3次，配成(20～40)× 106/mL 的淋巴细胞生理盐水悬浮液，细胞悬液量约2 mL，并分装于2支注射器中，然后给患者前臂内侧行多点(6～8 个点)皮内注射。从准备怀孕前3个月开始治疗，每3～4周治疗1次，3次为1个疗程，治疗过程中避孕，3 个疗程后复查BA，阴性者继续治疗，阳性者则鼓励患者在3个月内妊娠，如获妊娠，则于孕5 周开始再进行1 次治疗，如未获妊娠重新进行1次免疫治疗。

1.2.3　BA 检测　免疫治疗前后抽取患者外周血2 mL，分离血清，用ELISA 试剂盒(由北京索奥生物技术有限公司提供)检测治疗前、后抗体的水平。结果记录为：阴性、弱阳性、阳性。

1.3　统计学处理　在每次免疫治疗1个月后检测BA，登记检测阴阳性;根据治疗后是否受孕及最终是否成功分娩来计算成功受孕率和成功分娩率。所有数据采用SPSS19.0 统计学软件处理，计数资料采用χ 2 检验，以犘<0.05 判断是否具有统计学意义。

2　结　　果

2.1　自然流产人群的BA 阳性率调查　以发生1次及以上自然流产史的门诊患者未调查对象，以ELISA 法检测BA，以阴阳性作为结果报告。在研究期间，共有486例自然流产史的患者检测了BA，其中BA 阴性率为87.8%(427/486)。由于地址信息、联系方式、治疗中断等多种原因，最终只有132例研究对象获得了全程数据，年龄20～41岁，平均28.39岁。

2.2　免疫治疗后BA 水平变化　132例BA 阴性患者进行免疫治疗后，有10 例患者经1 次治疗后BA 转阳，阳性率为7.5%(10/132);有42 例经2 次治疗之后BA 转阳，转阳性率为31.8%(42/132)，前2次治疗后合计转阳率为39.4%;经3次治疗后有46例BA 转为阳性，阳性率为34.8%(46/132)，3次治疗后合计转阳率为74.2%，4 次治疗合计转阳率为77.8%。

2.3　免疫治疗后妊娠结局　在接受免疫治疗的132 例患者中，经4次治疗后BA 转阳103 例，另29 例经4 次治疗后BA仍为阴性。经3次治疗后，无论BA 是否转阳，均鼓励患者在3个月内进行妊娠，共有132例受孕。132例患者于孕5周后再进行1～2次免疫治疗，103例BA 转阳患者中，有82例成功妊娠，9例再次发生流产，成功分娩率为79.6% (82/103)。而另经免疫治疗后BA 仍为阴性的患者29 例中，22 例受孕(75.8%，22/29)，其中成功分娩11 例(50.0%，11/22)。免疫治疗后BA 转为阳性者获得妊娠成功率明显高于BA 仍为阴性者的妊娠成功率，差异有统计学意义(p<0.01)。

3　讨　　论

现代生殖免疫学认为，妊娠是一种半同种异体移植，正常的妊娠中，母体中存在着一种抗丈夫淋巴细胞的特异性IgG抗体，即BA。研究发现，RSA 的发生与母体缺乏BA 或者水平低下有关，BA 的缺乏或产生不足，使得母体免疫系统对胎儿或胚胎产生强烈的排斥反应，或通过释放炎性介质间接损害胎儿或胎盘，导致孕妇在怀孕早期出现RSA，怀孕晚期则可出现其他并发症如妊娠高血压疾病、胎儿宫内生长受限，甚至出现胎死宫内，最终导致流产[56]。1981年有研究者对4例APLA 阴性习惯性流产病人进行HLA 免疫治疗后3例分娩了婴儿，引起围产医学界的极大兴趣[3，7]。近年来，对BA 缺乏的RSA 患者应用配偶的淋巴细胞进行免疫治疗，已有较多的文献报道。本研究对入选病例严格筛选，排除其他致病因素，最终选择了132例进行淋巴细胞治疗。治疗后有70.4% 的患者成功分娩。本研究中BA 的转阳率与文献报道基本符合，成功分娩率稍稍偏高[8]，造成成功率差异的原因考虑如下：(1)病例数太少导致统计缺乏可信度(国内相关文献病例数多数少于100例);(2)对患者进行治疗的时间及流程没有进行严格要求，导致妊娠成功率下降;(3)治疗过程中，出现除BA 阴性以外的其他导致不孕或者流产的原因(如母方感染妇科疾病、外力因素导致的意外流产等)而未进行系统排除[9]。在132例接受治疗的RSA 患者中，有29 例BA 经4 次治疗后仍为阴性，主要考虑为以下原因：(1)淋巴细胞提供者与患者之间的HLA 相容程度过高，无法刺激患者产生BA;(2)本次对BA 进行的是定性检测，无法观察治疗过程中BA 水平的微量变化;(3)患者本身免疫耐受低下;(4)部分淋巴细胞提供者的淋巴细胞活性较低，在对患者进行注射之前已经失去大部分活性。于淋巴细胞免疫治疗过程中至患者成功分娩后1个月对患者进行定期回访，并对新生儿进行为期1个月的观察，没有发现母婴产生相应的副反应。在操作过程中，严格按照无菌操作的要求，尽可能地减少污染，尽可能地洗涤干净，去除红细胞及其他血液成分，最大限度地避免对患者造成不必要的免疫反应而引起身体不适[10]。对于BA 阴性的患者，在妊娠前、妊娠中应用配偶(或第三方)淋巴细胞主动免疫治疗，可以改变RSA 患者的BA 水平，能有效地提高BA 的阳性率及再次妊娠的成功率。淋巴细胞主动免疫治疗RSA 安全有效，治疗过程中及治疗后对母体及胎儿均无副作用产生，对指导RSA 患者妊娠及对再次妊娠的结局有良好的参考价值。

参考文献

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[8] SzpakowskiA，MalinowskiA，GlowackaE，etal.Theinfluenceofpaternallymphocyteimmunization onthebalanceof Th1/Th2typereactivityinwomenwithunexplainedrecurrentspontaneousabortion[J].GinekolPol，2000，71(6)：586592.

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[10]张瑞群.淋巴细胞免疫治疗自然流产49例分析[J].中国实用医药，2010，5(15)：9798.(收稿日期：20120720)