产妇外周血和胎儿脐血白细胞介素28启动子甲基化差异研究

　　传统产前诊断获取胎儿组织的方法，如羊膜腔穿刺、绒毛膜取样、脐带取血等均具有创伤性，对胎儿和产妇都有一定的危险性[12]。近年来随着分子生物学技术的不断发展和对遗传病认识的不断深入，应用表观遗传学DNA 甲基化技术，从母亲和胎儿DNA 甲基化的差异性上突破母血中检测胎儿DNA技术的局限已取得很大的进展[34]。前期工作中笔者采用甲基化芯片筛选到产妇外周血和胎儿脐血中甲基化差异基因白细胞介素28(IL28)启动子。本研究主要通过临床标本分析IL28启动子在产妇外周血和胎儿脐血中的甲基化差异及其机制，并探讨其对IL28合成和分泌的影响。

1　资料与方法

1.1　一般资料　随机收集武汉大学中南医院2009 年1～10月产妇100 例。分别采集产妇肘静脉血及产后脐带血，1000r/min离心10min，血清置-70 ℃ 保存待测，同时采用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞(PBMC)。所有产妇均知情同意，并经医院伦理委员会批准。

1.2　方法

1.2.1　亚硫酸盐修饰基因组DNA　采用Qiangen公司提供的试剂盒提取全血基因组DNA，紫外分光光度计进行定量，取基因组DNA 2 μg，0.2 mmol/L NaOH 变性后，加入3.1mmol/L 亚硫酸钠和0.5 mmol/L 氰醌，样品置55 ℃ 水浴16h，采用DNA CleanUpSystem 试剂盒纯化处理过的基因组，加入0.3mmol/L NaOH，再以2.5 倍体积的无水乙醇沉淀，沉淀溶解于30μLTE 缓冲液。

1.2.2　甲基化特异性PCR(MSP)　采用甲基化PCR 引物设计软件MethPrimer 设计引物，引物M：5′TGT ATG TTTATA GTT TTT TTT ATT CGG3′(上游引物);5′AAACTA ATCTCGAACTCTTAACGTC3′(下游引物)。引物U：5′TGT TTA TAG TTT TTT TTA TTT GG3′(上游引物);5′AACTAA TCT CAA ACT CTT AAC ATC3′(下游引物)。其中引物M 用于扩增甲基化DNA，引物U 用于扩增未甲基化DNA，βactin 作为参照。以亚硫酸盐修饰基因组DNA 作为模板进行PCR，产物以1% 琼脂糖进行凝胶电泳检测。

1.2.3　甲基化酶活性的检测　采用淋巴细胞分离液分离产妇外周血和脐带血PBMC，加入细胞裂解液，全细胞裂解液或者核抽提物经过蛋白质浓度定量之后，使用甲基化酶活测定试剂盒测定甲基化酶活性。

1.2.4　RTPCR 检测　按照Trizol试剂说明书分别提取产妇外周血和脐带血的总RNA。以总RNA 为模板进行RTPCR，反转录合成相应的cDNA。再以cDNA 作模板，用IL28基因的检测引物5′AGT GCT GGT GCT GAT GGC3′(上游引物)，5′GTG GGC TGA GGC TGG ATA3′(下游引物)进行PCR 扩增，同时用βactin 的检测引物5′ATG ATA TCGCCGCGCTCG3′(上游引物)，5′CGC TCG GTG AGG ATCTTC A3′(下游引物)进行平行PCR 扩增，产物以1% 琼脂糖进行凝胶电泳检测。

1.2.5　ELISA 法检测IL28　取100μL 血清加入到ELISA板小孔中，4 ℃包被过夜，PBS 洗ELISA 板5 次。配3% 脱脂奶粉，用PBST 溶解，每孔100μL 加入到ELISA 板中，4 ℃封闭过夜。用PBST 洗ELISA 板5 次。IL28 抗体用PBST 按1∶100稀释，每孔加100μL，37 ℃ 放置1h，用PBST 洗5 次。辣根过氧化物酶偶联的兔抗羊IgG 用PBST 按1∶5000 稀释，37 ℃放置30 min，用PBST 洗5 次。每孔分别加入显色液，37 ℃避光显色5min。每孔加终止液1滴，酶标仪读数。1.3　统计学处理　用SPSS13.0 统计软件包进行统计分析。组间计量数据比较采用狋检验，犘<0.05 为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　IL28基因启动子甲基化检测结果显示，在产妇外周血未发现甲基化IL28启动子，而在胎儿脐血甲基化IL28 启动子检出率为100%(图1)，表明IL28 启动子在胎儿均以甲基化形式存在，而在产妇中为非甲基化形式。

2.2　甲基化酶活性检测结果显示，在全细胞水平上，产妇外周血和胎儿脐血甲基化酶的活性无统计学差异(犘>0.05);而对于核抽提物来说，胎儿脐血核内的DNA 甲基化酶的活性增加，见图2。表明胎儿IL28基因启动子甲基化水平升高可能是由于脐血核内的DNA 甲基化酶活性升高引起的。

2.3　RTPCR 检测产妇外周血和胎儿脐血PBMC 中IL28mRNA 的表达，结果见图3，IL28 mRNA 的表达水平在胎儿脐血明显低于产妇外周血，表明IL28启动子的甲基化能够在转录水平调节IL28的表达。

2.4　ELISA 法检测产妇外周血和胎儿脐血IL28血清水平结果显示，与胎儿脐血中IL28水平[(37.9±5.6)pg/mL]相比，产妇外周血中IL28 水平[(51.4±7.6)pg/mL]显著升高，差异有统计学意义(犘<0.01)。

3　讨　　论

表观遗传学信息的改变，可导致基因转录抑制、基因组印记、细胞凋亡、染色体灭活以及肿瘤发生等[5]，而表观遗传学最具特征的就是DNA 甲基化。在前期工作中笔者采用甲基化芯片筛选了产妇外周血和胎儿脐血中基因组DNA 的甲基化差异，其中IL28 基因启动子的甲基化水平在胎儿脐血升高。MSP 是一种分析目的DNA 序列是否甲基化的快速、定性方法，其灵敏度高。由于甲基化芯片存在一定的假阳性，笔者采用MSP对芯片结果进行了验证，结果发现在产妇外周血未发现甲基化IL28启动子，而在胎儿脐血甲基化IL28 启动子检出率为100%，这与甲基化芯片结果相一致。

DNA 甲基化由DNA 甲基转移酶催化，在多种调节因子的参与下，与组蛋白修饰相互作用，抑制基因转录，导致基因沉默[6]。为探讨产妇外周血和胎儿脐血IL28 启动子甲基化差异的机制，笔者采用淋巴细胞分离液提取了产妇外周血和胎儿脐血的PBMC，采用甲基化检测试剂盒对全细胞和核抽提物的甲基转移酶活性进行了检测，结果发现在全细胞水平，两者PBMC 中DNA 甲基转移酶活性改变不大(犘>0.05)，而对于核抽提物而言，胎儿脐血PBMC 甲基转移酶活性明显升高(犘<0.05)。这说明胎儿脐血PBMC 细胞核中DNA 甲基转移酶活性升高是导致IL28启动子高甲基化的重要原因。

由于启动子甲基化会导致细胞很多基因表达水平的降低或沉默，为探讨IL28启动子甲基化对IL28 转录表达水平的影响，笔者采用RTPCR 对IL28 mRNA 的水平进行检测，结果表明IL28mRNA 在胎儿脐血PBMC 中的含量降低，说明IL28启动子的甲基化能够在转录水平影响IL28的表达。进一步检测IL28 在蛋白水平的变化，结果显示产妇外周血中IL28的表达水平明显高于胎儿脐血中IL28的表达水平(犘<0.01)，表明IL28启动子的甲基化在转录水平抑制了IL28的表达，进而在蛋白水平抑制其合成和分泌。但IL28启动子上哪些位点被甲基化，其具体调节机制如何，尚待深入探讨。

综上所述，笔者分析了产妇外周血和胎儿脐血中IL28基因启动子甲基化的差异，并通过临床样本检测两者IL28 的mRNA 和蛋白水平，证实胎儿脐血细胞核内DNA 甲基化酶活性升高导致IL28启动子高甲基化，引起IL28 合成和分泌降低，可为临床无创伤性产前诊断提供参考。

参考文献

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