应用高通量基因测序技术测定稽留流产胚胎染色体异常及临床意义

自然流产的病因包括胚胎因素、母体因素、免疫因素、环境因素等，临床上约有50%以上的早期流产是与胚胎染色体异常有关，染色体异常包括染色体数目异常和结构异常，且大多数为染色体数目异常。稽留流产是指胚胎或胎儿已死亡仍滞留在宫腔内尚未自然排出者[1]。国内外有关稽留流产染色体异常检测方法的文献报道虽有许多，如传统的流产绒毛培养染色体核型分析、FISH检测技术等，都存在缺陷。为探索稽留流产染色体检测的最佳方法，我院妇科进行了应用高通量基因测序技术测定稽留流产胚胎染色体异常及临床意义的课题研究，现报告如下。

1资料与方法

1.1研究对象：选择2012年3月～2013年11月在深圳市盐田区人民医院住院的稽留流产妇女，孕龄8～13周，患者年龄22～39岁，平均31岁。经血绒毛膜促性腺激素、孕酮值两次对照检查无上升，反而下降，B超提示胚胎停止发育(无心管搏动)。排除孕期感染及有害物质接触史。自愿要求流产绒毛组织染色体检测者，签署知情同意书。

1.2检测方法

1.2.1样本准备与测序：取稽留流产行清宫术的绒毛组织100 mg，通过Qiagen QIAamp DNA Mini试剂盒提取全基因组DNA(gDNA)，并用Quant-iT dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen)进行定量。之后，每个样本取50 ng的gDNA，按照优化的Illumina建库流程进行文库构建(gDNA打断，末端修复，末端加“A”，接头连接)。其中，我们用Agencourt AMPure Kit(Beckman)试剂盒对每一步反应后的片段DNA进行纯化，并以连接接头后纯化的DNA作为模板进行10个循环的PCR。将PCR产物用Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Kit(Agilent Technologies)和real-time quantitative PCR对其分别进行测序前片段长度和浓度的定量，确认满足Illumina Hiseq2000测序要求。

1.2.2测序数据产出：按50 SE单末端、30M数据量，在Hiseq 2000上进行测序。用SOAP2比对软件，将每个读长的测序碱基与人类基因组参考序列(build 37，hg19)进行比对，只取用唯一比对的读长(UR)数据进行后续非整倍体分析。

1.2.3非整倍体分析策略或算法：样本编号用J表示，将基因组各条染色体号用I表示，计算每个样本各条染色体的UR数量--定义为uri，j。计算各染色体对应UR%的算数平均值(meani)和标准差(sdi)。24号染色体中，正常倍数的染色体可以作为异常倍数染色体的内部正常参照。按照uri，j-meani/sdi计算得到Z-score，当z-score≥3时可认为是三体，z-score≤3时刻认为是单体。正常倍数的染色体-3<z-score<3。

1.2.4绒毛组织染色体核型分析：无菌收取稽留流产的绒毛组织5～10 mg。①绒毛细胞培养：抽吸出的绒毛于生理盐水中洗涤以防母体细胞污染，剪碎后分两瓶接种于5 ml Amniomax全培养基中。1周后换液，用倒置显微镜观察细胞生长情况。发现瓶底有较多绒毛细胞生长(成纤维状)时收获细胞进行染色体制片。②G显带染色体片制作：培养液中加入秋水仙素(终浓度为0.5μg/ml)混匀，37℃水浴下低渗10 min，加入新鲜配置的固定液2 ml预固定，离心，弃上清液，加1∶3固定液6 ml，固定60 min，离心10 min，弃上清液;再固定一次，20 min，离心弃上清液，制片1～2张行常规G显带染色体核型分析。每份标本至少计数20个分裂相，分析3个核型。2结果2.1高通量基因测序技术检测结果：44例稽留流产的绒毛组织检测成功率为100%，检测出染色体正常标本16例，异常标本28例，检出率为63.64%，三体型23例，占82.14%，其中常染色体数目异常20例;23-三体共10例，其中单纯23-三体5例，占17.86%，合并其他类型的23-三体5例，占17.86%;性染色体数目异常3例，占10.71%;染色体缺失/重复3例，占10.71%;45X 2例，占7.14%。详见表1。

2.2　10例标本同时进行了传统的绒毛组织培养染色体核型分析：有效标本9例，检测出染色体异常标本4例，其中三体型3例，45X 1例，与高通量基因测序技术检测结果相同。1例标本因稽留流产时间过长而培养失败，此标本经高通量基因测序技术检测为23三体。1例检测为正常的标本经高通量基因测序技术检测为染色体18号重复10号长臂0.5 Mbp缺失。

3讨论

随着细胞遗传学的不断发展，由染色体异常引起的自然流产、胎儿畸形、死胎及死产越来越受到重视。现在普遍的观点认为：早期自然流产中约50%存在胚胎染色体异常;也有学者[2]认为：染色体异常的实际情况可能明显高于这个比例，只是常规细胞遗传学方法检出率偏低。可见，探索出能准确全面检测早期自然流产胚胎染色体异常的方法很有必要。目前国内常规使用传统的流产绒毛组织细胞培养核型分析，可以准确检出自然流产物或胎儿染色体结构和数目的异常，是明确病因或产前诊断的“金标准”，但此方法对标本要求高，检验周期长，操作过程繁琐。绒毛组织易受微生物污染，尤其是稽留流产胚胎在宫内滞留时间长、生长活力差，使绒毛组织培养失败率较高。此外，对染色体小片段缺失无法检测。古艳等[3]220例稽留流产患者绒毛组织培养成功212例，培养成功率96.36%，余8例因不明原因污染培养失败。本研究10例标本进行绒毛培养1例标本因稽留流产时间过长而培养失败，此样本经高通量基因测序技术检测为23三体。1例检测为正常的样本经高通量基因测序技术检测为染色体18号重复10号长臂0.5 Mbp缺失。FISH技术的出现弥补了绒毛细胞培养的缺陷[4]，虽然FISH技术具有对标本要求低，可对污染标本进行快速检测，可弥补“金标准”不足，但目前国内进行自然流产遗传学病因检测的FISH探针仅涉及染色体13、16、18、21、22、X/Y，以上7组探针仅能覆盖染色体数目异常的81.3%，不能检测常常染色体和1组性染色体，约有近20%的患者出现漏诊。若FISH探针覆盖对常染色体和1组性染色体，则其价格将极其昂贵，不适合临床应用及推广。

另外目前进行自然流产染色体数目异常检测的FISH探针不能针对染色体结构进行检测，易导致约2%～5%染色体结构异常夫妇反复流产病因不明确。高通量基因测序技术可以弥补“金标准”和FISH技术的不足，具有批量、全面、快速、准确的优点。对标本要求低，可对污染、绒毛退化标本进行检测，可检测到0.5 Mbp以上的染色体片段缺失。本研究染色体异常检出率为63.64%，高于古艳等报导的55.56%，可能与全基因检测，能发现包括染色体数目、结构异常和片段缺失有关。

另外，盐田区位于深圳市东部，距离大亚湾核电站较近，染色体异常高于文献报道是否与此有关需进一步考证。综上所述，绒毛染色体检查可对稽留流产的原因及时作出遗传方面的判断，染色体异常是稽留流产的主要原因。主要为染色体数目异常，三体型最多，占82.14%，以23-三体为主，缺失?重复次之。对于稽留流产病例，特别是两次及两次以上的稽留流产者，建议进行绒毛染色体检查，染色体异常的病例建议夫妻双方行外周血染色体核型分析，确定是否遗传因素造成的，染色体无异常时，建议其做其他相关检查，改变不良生活方式，属于遗传因素引起的，建议其改受孕方法或在孕早期做产前诊断，以确定胎儿是否再次出现染色体异常。高通量基因测序技术检测绒毛染色体具有高通量、快速、准确、全面的优点。有望成为稽留流产绒毛染色体检测的主要手段。

4参考文献

[1]乐杰，谢幸，林仲秋，等.妇产科学[M].北京：第7版.人民卫生出版社，2008：83-84.

[2]陈雪，胡娅莉.自然流产的遗传因素及诊断[J].国外医学：妇产科分册，2004，31(6)：340.

[3]古艳，谢建生，罗福薇，等.220例稽留流产者绒毛组织细胞遗传学分析[J].中国优生与遗传杂志，2009，17(12)：38.

[4]宋兰林，熊丽，刘思平，等.FISH技术在快速诊断自然流产胚胎染色体数目异常中的应用[J].南方医科大学学报，2011，31(9)：1607.