艾灸穴位对大鼠心肌缺血-再灌注损伤心肌细胞凋亡基因的影响

　　作者：孟　君 作者单位：(成都大学附属医院康复科，四川 成都　610081)

　　【摘要】 目的：研究艾炷灸膻中、膈俞穴益气活血法预处理对大鼠心肌缺血-再灌注损伤心肌细胞凋亡基因的影响。为临床防治心肌缺血-再灌注损伤提供新的思路和方法。方法：先结扎大鼠冠状动脉左前降支(LAD)，形成心肌缺血，观察线扎紧部位心肌的颜色，再灌注后取心脏进行病理学观察，免疫组化法测caspase-3、bcl-2蛋白表达。结果：(1)凋亡标志因子caspase-3在心肌缺血再灌注损伤后表达增多，艾炷灸膻中、膈俞穴益气活血法预处理可降低其表达。(2)抑凋亡基因bcl-2在心肌缺血再灌注损伤后表达减少，艾炷灸膻中、膈俞穴益气活血法预处理可使bcl-2表达增多。结论：艾炷灸膻中、膈俞穴益气活血法预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤起抑制作用。其作用可能通过降低caspase-3表达，增高bcl-2表达来表现。

　　【关键词】 心肌缺血-再灌注损伤,凋亡基因,膻中穴,膈俞穴;艾炷灸;大鼠

　　[ABSTRACT] Objective： To study the effects of moxibustion pretreatment in rats with myocardial apoptosis induced by ischemia-reperfusion. Methods：The left anterior descend coronary artery was legated to establish the ischemia-reperfusion heart model in rats. Immunohistochemical staining was used to detect the changes of apoptosis and protein expression of caspase-3、bcl-2. Histopathological changes in myocardium was also observed.Results： 1. The expression of caspase-3 gene increased by ischemia-reperfusion and decreased by pretreatment of moxibustion of the Danzhong and Geshu points. 2. The expression of bcl-2 gene decreased by ischemia–reperfusion and increased by pretreatment of moxibustion the Danzhong and Geshu points. Conclusions：Moxibustion pretreatment by nourishing the Qi and activating blood flow shows obviously preventive and therapeutic effects on reperfusion injury and could inhibit cardiomyocyte apoptosis by decreasing bcl-2 gene expression and increasing caspase-3 gene expressing.

　　[KEY WORDS] Myocardial ischemical reperfusion injury; Apoptosis; Danzhong; Geshu; Moxibustion; Rats

　　自20世纪50年代以来，心血管疾病的患病率和死亡率呈逐年上升趋势。从1990年全国疾病监测系统获得的疾病报告看，冠心病已经成为我国城市居民的第一位死因。最新的流行病学研究表明，我国冠心病新发病例达到75万/年。目前除了药物治疗外，针对冠心病的介入治疗研究非常活跃，随着冠状动脉溶栓术、经皮冠状动脉球囊扩张术(PTCA)、冠状动脉内扩张术、冠状动脉内斑块切磨术等技术的推广应用，随之出现的心肌缺血-再灌注损伤(myocardial reperfusion injury， MRI)现象更加受到广大基础与临床研究者的重视。虽然近年来心肌保护技术不断提高，但介入手术后，心肌缺血再灌注损伤仍会出现。因此，缺血后心肌的保护研究成为心血管领域的重点。其中，在缺血再灌注损伤发病机制中细胞凋亡可能是一个重要环节[1]，设想从针灸的早期预防性干预出发，为临床提供一个新方法。本试验先建立大鼠心肌缺血再灌注模型，测定各组凋亡标志因子caspase-3和凋亡相关基因bcl-2来研究艾炷灸益气活血预处理对心肌缺血-再灌注损伤心肌细胞凋亡的作用及机理。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物

　　孟君.艾灸穴位对大鼠心肌缺血-再灌注损伤心肌细胞凋亡基因的影响　由成都中医药大学实验动物研究中心提供的，体重(220±10)g的SD大鼠32只，雌雄各一半，检验检疫后备用。

　　1.2　实验仪器

　　ALC-V8D型小动物呼吸机(由上海奥尔科特生物科技有限公司研发制造)，日本奥林巴斯光学显微镜(BX50型)，BL-410生物机能实验系统(由成都泰盟科技生产)，川大图象分析研究所研制的Mias-2000图形分析系统。

　　1.3　实验试剂

　　一抗：caspase-3(H-277);兔抗 IgG;200ug/ml;Bcl-2(c-2)：鼠抗 IgG1;200ug/ml (由SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY，INC.提供) Caspase-3、bcl-2试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司。4%的戊巴比妥钠、10%的福尔马林液和0.9%的氯化钠注射液。

　　1.4　方法

　　1.4.1　实验动物分组

　　研究对象为32只SD大鼠，体重(220±10) g，雌雄各一半。按照大鼠的体重和性别随机分为：(1)空白组：左冠状动脉只穿线不结扎(LAD);(2)模型组：LAD结扎30 min后松开结扎线，再灌注30 min ;(3)艾炷灸膻中、膈俞穴益气活血法组(以下各表简称益气活血法组)：将麦粒大艾炷放在膻中和膈俞穴上面，每天灸5壮，共灸14 d;⑷硫氮卓酮组：用硫氮卓酮(30倍临床用量，30 mg/kg?d-1)作为对照药物。

　　1.4.2　实验动物建模

　　用4%戊巴比妥钠按照40 mg/kg的比例将大鼠麻醉后固定在手术台上。切开气管用笔形静脉留置针进行气管插管，连接动物呼吸机，参数为呼吸频率85次/分，呼吸比1：1 ，潮气量18 mL。

　　胸前被毛，酒精消毒后打开胸腔，分离肌肉露出肋骨，右手持剪刀剪开肋骨后用左手将心脏挤出胸腔。先在左心耳与肺动脉圆锥间找到与左冠状动脉伴行的心大静脉，拉紧丝线连同心大静脉一起结扎冠状动脉左前降支，形成心肌缺血并观察线扎紧的部位心肌的颜色是发白的(空白组只穿线不结扎)，后将心脏迅速放入胸腔。连上电极，观察心电图是否符合缺血导致的异常心电图。若符合结扎成功的心电图标准，应剪断结扎线，再灌注30 min后停止试验，取出心脏，洗净血迹，放入福尔马林液中。再次观察心电图是否有再灌注心律失常。

　　结扎成功的心电图：结扎后1～2 min内可见J点或ST段抬高，呈弓背向上的单向曲线。心电图J点抬高与高耸的T波相融合，并可见室早二联律。

　　LAD结扎30 min后，心电图上II导联ST段明显抬高 (〉0.2 mV)、结扎线以下心肌颜色变暗，然后松开结扎线，再灌注30 min，以抬高的ST段下降1/2以上、心肌颜色逐渐变红为再灌注成功。

　　1.4.3　选穴

　　膻中、膈俞 膻中、膈俞穴位定位参照《实验针灸学》的动物穴位图谱。将麦粒大艾炷放在膻中穴、膈俞穴上，用香点燃，每天灸5壮，共灸14 d。灸后进行心肌缺血再灌注损伤实验。

　　1.4.4　观察项目及检测方法

　　(1)caspase-3检测。免疫组化，SP染色。在显微镜200倍下用图形分析系统定量观察。方法：测量单位视野染色区域的面积，积分光密度。(2)bcl-2检测。免疫组化，SP染色。在显微镜200倍下用图形分析系统定量观察。方法：测量单位视野染色区域的面积，积分光密度。

　　1.5　统计学处理

　　实验数据均以均数和标准差(x-±s)表示。数据采用SPSS13.0统计软件进行，用One-Way ANOAY方差分析，两组间比较采用LSD及S-N-K分析。用组间t检验。P<0.05差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　caspase-3检测结果

　　凋亡标志因子caspase-3在心肌缺血再灌注后表达明显增多，用艾炷灸益气活血预处理后其表达明显降低并有统计学意义。见表1。

　　2.2　bcl-2检测结果

　　表1　caspase-3各组结果比较表2　bcl-2各组结果比较抑凋亡基因bcl-2表达在心肌缺血再灌注损伤后表达明显减少，用艾炷灸益气活血法预处理后其表达明显增高并有统计学意义。见表2。

　　3　讨论

　　心肌缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury ， IRI)指在短时间心肌血供中断一定时间内恢复血供，原缺血心肌发生较血供恢复前更严重的损伤[2]。良好的血液循环是组织细胞获得充足的氧和营养物质供应并排出代谢产物的基本保证，各种原因造成的组织血液灌注量减少可使细胞发生缺血性损伤(ischemia injury)，尽早恢复组织的血液灌注是减轻缺血性损伤的根本措施。

　　细胞凋亡是指在一定的生理或病理条件下，细胞遵循自身的程序，通过启动内部机制，主要是内源性DNA内切酶的激活，自己结束其生命的过程。在整个过程中涉及到一系列特殊基因的表达，随之细胞发生特征性的形态学和生化改变。常被称为程序化细胞死亡(programmed cell death， PCD)。细胞凋亡是形态学的概念，而程序化细胞死亡是功能上的概念，它们都属于生理性的细胞死亡，而不是坏死性的改变。

　　caspase-3的结构：含有277个氨基酸残基，分子量约为32kd。caspase-3在细胞凋亡中起着不可替代的作用。caspase-3目前被认为是各种细胞凋亡过程中的关键酶，既能接受凋亡信号，成为凋亡的执行者，又是凋亡效应器，发生胞内的级联反应，水解各种成分，使细胞解体，形成凋亡小体。是凋亡发生过程中所需要的一种重要的蛋白酶，同时也是凋亡发生的标志酶。bcl-2最先被注意到与细胞凋亡有密切关系的基因之一。bcl-2是一种原癌基因，是B细胞淋巴瘤/白血病-2基因的缩写形式，是第一个被确认有抑制凋亡作用的基因，有很强的抑制细胞凋亡的作用。

　　取穴为膻中、膈俞的依据：膻中为气会，有益气的功效，膈俞为血会，有活血的功效。灸法是中医传统外治法之一，对人体可起到治疗疾病和预防保健作用。艾是最常用的灸用燃料。艾叶，苦、辛、温，归肝、肾、脾经。其性温热，善走窜，通过在体表穴位的熏灼燃烧，更加强了其温热助阳的作用。通过穴位-经脉-脏腑的传导，起到疏风散寒，温经通络，行气活血，温中和里，回阳复脉，升举阳气，化瘀通痹，清热解毒，消肿散结，增补元气，强壮脏腑，保健防病的良好作用。

　　综上所述，在大鼠心肌缺血再灌注模型建模以前，先艾灸其膻中和膈俞穴，起到益气活血的作用，造模后从实验数据中caspase-3和bal-2的表达来看，艾炷灸预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤起到抑制作用。

　　【参考文献】

　　1　张春芳，周亚滨，韩佳瑞等.益新胶囊对家兔急性心肌缺血模型细胞凋亡的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2003,1(8)：459.

　　2　Schulze CJ， Wang W， Kunari R. Im balance between tissue inhibitor of metalloproteinase-4 and metalloproteinases during acute correction of myocardial ischemia-reperfusion injury[J] .Circulation,2003,107(19)：2487-2492.