原花青素对β淀粉样肽（2535）诱导 PC12 细胞bax和bcl2基因表达的影响

　　作者：梅寒芳,谢朝阳,祝其锋　　作者单位：广东药学院生物化学与分子生物学教研室，广东 广州 510006

　　【摘要】目的探讨原花青素 (Procyanidins，PC) 对β淀粉样肽(2535)(Aβ25～35) 诱导凋亡PC12细胞bax和bcl2基因表达的影响。方法 采用MTT比色法分析细胞存活率，Hoechst33258PI荧光染色观察细胞核凋亡的形态学改变，RTPCR 检测bax和bcl2基因 mRNA 表达，Western blot检测Bax和Bcl2蛋白表达。 结果 不同剂量PC预处理 PC12细胞 1 h，可剂量依赖性对抗Aβ25～35引起的细胞凋亡，增加细胞存活率，减少Aβ25～35引起的细胞核固缩、核碎裂，降低bax mRNA及Bax蛋白表达，增加bcl2 mRNA及Bcl2蛋白表达。 结论 PC可剂量依赖性对抗Aβ25～35诱导的 PC12细胞凋亡，其机制可能与下调凋亡基因bax和上调抗凋亡基因bcl2表达有关。

　　【关键词】 原花青素,Aβ25～35 PC12细胞,bax bcl 2

　　【Abstract】 Objective To discuss the mechanisms of protection of procyanidins (PC) on bax and bcl2 expression of apoptotic PC12 cells induced by βamyloid peptide (Aβ)2535. Methods The cell survival rate of PC12 cells was determined by MTT colorimetric technique, the morphology change of nucleus apoptosis was observed by HoechstPI fluorescence staining, and the expression of bax and bcl2 mRNA and level of Bax and Bcl2 protein were detected by RTPCR and Western blot respectively. Results Different concentrations of PC for 1 h inhibited apoptosis induced by Aβ2535 and increased survival rate, decreased karyopyknosis and karyorrhexis, descended bax mRNA and bax protein expressions with dosage dependency manner. Conclusions PC prevents apoptosis of PC12 cells induced by Aβ2535 through decreasing the bax gene expression, and increasing the bcl2 gene expression.

　　【Key words】 Procyanidins; Aβ2535; PC12 cells; bax;bcl2

　　β淀粉样肽(βamyloid peptide，Aβ)是老年斑的重要成分〔1〕。研究表明，Aβ在脑实质中沉积是阿尔茨海默病(AD)病人神经元凋亡的主要原因之一，国内外学者正致力于探讨Aβ诱导神经元凋亡的机制及筛选抗Aβ诱导神经元凋亡的有效药物〔2，3〕。原花青素(Procyanidins，PC)是植物中广泛存在的一种多酚化合物，是植物体内天然的抗氧化物质。它主要存在于植物的果实、种子、花和皮中，在葡萄、山楂、花生、松树等植物中含量丰富〔4〕。我们已观察到PC对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡有明显的保护作用〔5〕，本文通过观察这一过程中bax和 bcl2等基因表达的变化旨在探讨原花青素的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　PC12细胞由军事医学科学院基础医学研究所马子敏博士惠赠;Aβ25～35购于Sigma公司;原花青素购自南京学子医化研发中心，纯度>95%;各种规格培养皿均为美国Corning Costar公司产品;DMEM及马血清购自Gibcol公司;胎牛血清为杭州四季青公司产品;琼脂糖为Amresco公司产品;小鼠抗大鼠Bax多克窿抗体、兔抗大鼠Bcl2多克窿抗体、ECL试剂为Santa Cruz公司产品;MMLV逆转录酶、Taq DNA 聚合酶、Oligod (t)、RNAsin为Promega公司产品;100 bp DNA maker为华美生物工程公司产品;其余试剂为国产分析纯;引物为上海生物工程公司合成。

　　1.2 细胞培养〔6〕

　　PC12细胞在DMEM基质中培养，其中加10%灭活马血清、5%胎牛血清和青霉素(100 U/ml)及链霉素(100 mg/ml)，于37℃、5% CO2培养箱中培养。

　　1.3 药物处理

　　PC12细胞培养24 h，用不同终浓度(0～50 mg/L)PC预处理1h，再加入终浓度为10 μmol/L 的Aβ25～35，继续培养24 h，收集细胞进行实验。每次实验均分对照组(0 μmol/L Aβ25～35)、10 μmol/L Aβ2535诱导组和药物保护组(PC+ Aβ25～35)，每组至少重复3次。PC用DMSO溶解，DMSO终浓度控制在0.1%(V/V)内，实验表明该浓度对细胞生长无影响。Aβ25～35用PBS (pH 7.4) 溶解。

　　1.4 MTT法检测细胞存活率

　　取对数生长期的PC12细胞以1×108/L接种于96孔板培养24 h，分别加入不同终浓度(5、10、20、30、40、50 mg/L)PC预处理1 h，再加入10 μmol/L Aβ25～35，继续培养20 h，每孔加入5 g/L MTT 15 μl，继续培养4 h，倒出培养液，每孔加入DMSO 100 μl，摇床震摇10～15 min，待紫色结晶完全溶解后，用M450型ELISA Reader酶标仪检测各组细胞的A570nm/A450nm吸光值，以A570 nm/A450 nm比值代表细胞活力，并以0 μmol/L Aβ25～35作为对照组，其细胞生长率为100%，计算其余各组细胞的生长率：

　　生长率=(各浓度组吸光值/对照组吸光值)×100%

　　1.5 细胞凋亡的细胞核形态学检测

　　取对数生长期的PC12细胞以2×108/L接种于6孔板，每孔2 ml，培养24 h，分别加入不同终浓度(10、20、30 mg/L)PC预处理1 h，再加10 μmol/L Aβ25～35，继续培养24 h，收集细胞于1.5 ml EP管中，冷PBS(pH7.4)洗2次，每管加Hoechst 33258至终浓度为5 mg/L和PI至终浓度为50 mg/L，37℃避光孵育30 min，于荧光显微镜下观察和拍照。

　　1.6 RTPCR检测bax和bcl2基因的mRNA表达

　　收集细胞提取总RNA，紫外分光光度仪测定A260nm/A280nm，比值在1.7～2.0之间，计算RNA含量。逆转录合成cDNA,再对其进行扩增，以GAPDH为内参照。引物序列如下：

　　Rat bax:(上游)5′TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG3′，(下游)5′TGGTTGCCCTTTTCTACTTTG3′;Rat bcl2:(上游)5′CTGGTGGACAACATCGCTCTG3′，(下游)5′GGTCTGCTGACCTCACTTGTG3′;Rat GAPDH:(上游)5′GGTGAAGGTCGGTGTCAACG3′，(下游)5′GAGCCCTTCCACGATGCCAA3′。

　　反应参数为：先95℃ 5 min，再94℃ 1 min，60℃或55℃ 45 s，72℃ 1 min 共30循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用2% 琼脂糖凝胶电泳分离检测。

　　1.7 Western blot检测Bax和Bcl2蛋白的表达

　　收集细胞，低温提取蛋白，考马斯亮蓝G250染色法(Bradford法)测定蛋白浓度。每孔上样50 μg，质量体积分数12% SDSPAGE分离样品。转膜，封闭，将膜与溶于封闭液中的一抗(小鼠抗大鼠Bax多克隆抗体1∶500，兔抗大鼠Bcl2多克隆抗体1∶500)室温孵浴2 h，洗涤，将膜浸入以1∶4 000体积比稀释的二抗稀释液，室温孵浴1.5 h，洗涤，加入ECL试剂，曝光，显影，定影，对X光片拍照，永久保存。

　　2 结 果

　　2.1 MTT结果

　　分别用0、5、10、20、30、40、50 mg/L PC处理细胞24 h，细胞的存活率并无明显改变(图1)。培养24 h的PC12细胞用终浓度为0～50 mg/L的PC作用24 h，与对照组(0 mg/L PC)比较无统计学意义(P>0.05)。

　　培养的PC12细胞用不同终浓度(5～40 mg/L)PC预处理1 h，再加入10 μmol/L Aβ25～35，继续培养24 h，细胞的存活率随PC剂量的增大而升高，具有明显的量效依赖性。5 mg/L PC即具有保护作用，30 mg/L PC时，细胞存活率与对照组比较无显著性意义(P>0.05)。见图2。

　　2.2 细胞凋亡的细胞核形态学改变

　　Hoechst 33258荧光染色结果显示，用10 μmol/L Aβ25～35处理细胞24 h，可见染为高亮蓝色的典型凋亡小体，其细胞核明显固缩、凝聚和断裂(图3A)，而药物保护组(10～30 mg/L PC +10 μmol/L Aβ25～35)的细胞核(图3C，D )与空白对照组细胞的细胞核(图3E)形态逐渐接近，说明PC对Aβ25～35诱导的细胞凋亡有明显的保护作用。

　　2.3 PC剂量依赖性降低bax mRNA的表达

　　RTPCR 结果显示，用终浓度为10，20，30 mg/L PC预处理细胞1 h，bax PCR产物的条带逐渐变暗;图像分析结果显示，随着药物浓度的增加bax mRNA的表达减少(图4)。

　　2.4 PC剂量依赖性增加bcl2 mRNA的表达

　　RTPCR显示，用终浓度为10、20、30 mg/L PC预处理细胞1 h，bcl2 PCR产物的条带逐渐变亮;图像结果显示，随着药物浓度的增加bcl2 mRNA的表达增加(图5)。

　　2.5 PC剂量依赖性降低Bax蛋白的表达

　　Western blot结果显示，用终浓度为10、20、30 mg/L PC预处理细胞1 h，Bax蛋白条带逐渐变细，图像结果显示，随着药物浓度的增加Bax蛋白的表达降低(图6)。

　　2.6 PC剂量依赖性增加Bcl2蛋白的表达

　　Western blot结果显示，用终浓度为10、20、30 mg/L PC预处理细胞1 h，Bcl2蛋白条带逐渐变粗，图像结果显示，随着药物浓度的增加Bcl2的表达增加(图7)。

　　3 讨论

　　β淀粉样肽(Aβ)在正常情况下存在于细胞膜上的β淀粉样前体蛋白(βamyloid precursor protein，APP)通过β和γ蛋白酶水解而生成，主要包括Aβ1～42/43和Aβ1～40两种，其中由25到35位氨基酸残基所组成的多肽片段，序列为GAIIGLM，为疏水性多肽片段，在体外水溶液中可逐步形成稳定的聚集，呈β片层状二级结构，这种聚集与这些肽的神经毒性直接相关，因此常用于作体外神经毒实验的AD模型〔7〕。

　　原花青素(Procyanidins，PC)是植物体内天然的抗氧化物质，其抗氧化作用是维生素E的20倍;是维生素C的50倍。此外，还具有抗衰老、防止紫外线损伤、促进血液循环、抗癌、改善免疫抑制等功效〔8〕。Guo等〔9〕研究表明，给小鼠口服葡萄籽提取物原花青素可以对抗乙醇诱导的脑组织DNA损伤，说明其对乙醇诱导的中枢神经系统损伤具有明显的保护作用。

　　本研究采用的PC也是一种葡萄籽提取物，纯度>95%，在研究中发现，PC本身对PC12细胞存活率无明显影响，10 μmol/L Aβ25～35可诱导PC12细胞凋亡，而10～30 mg/L PC预处理1 h，可剂量依赖性增加Aβ25～35诱导后PC12细胞的存活率，降低凋亡率，抑制Aβ25～35引起的PC12细胞核固缩，核碎裂等。bax和bcl2是研究最早的与凋亡有关的一对基因，一般认为，Bcl2通过抑制诱导凋亡的信号而起作用，它可防止或延迟由γ辐射、糖皮质激素、热休克和多种化疗药物所引起的凋亡;而bax是一种促进凋亡的基因，bax和bcl2的表达比值，是调节细胞是否发生凋亡的重要因素。P53是一种转录激活蛋白，是bax和bcl2的调节因子，可通过上调bax,下调bcl2，使Bax与Bcl2比值升高，而促进细胞凋亡〔10〕。本课题组前期的研究结果表明PC对Aβ25～35诱导PC12细胞凋亡的保护作用可能与下调p53基因表达有关〔11〕，而本研究又表明PC可上调Aβ25～35诱导后PC12细胞的bcl2基因表达，下调bax基因表达。综合本课题组前后的研究结果，PC对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡有明显的保护作用，其机制可能是通过抑制p53基因表达，进而下调促凋亡基因bax表达，上调抗凋亡基因bcl2表达，从而使Bax与Bcl2比值降低而发挥抗凋亡作用。

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　　10 姜 泊.细胞凋亡基础与临床〔M〕.北京：人民军医出版社，1999：1640.

　　11 梅寒芳，谢朝阳，祝其锋.原花青素对Aβ25～35诱导PC12细胞凋亡的影响及其机制的研究〔J〕.中国药理学通报,2005;21(2):22731