重度子痫前期患者血清对人脐静脉血管内皮细胞的氧化性损伤研究

子痫前期患者的主要临床表现均与系统性的吼管内皮细胞损伤有关,血管内皮细胞损伤是引发子痫前期的核心问题[1] 。但是,子痫前期患者血管内皮细胞损伤的机制目前仍不清楚「2」。通常认为,可能是由母体巾液循环中来源于胎盘的炎症囚子引发了渐管内皮细胞的炎症和损伤,这些囚子包括炎症性细胞囚子、合体滋养细胞微颗粒及过氧化脂质等[3-4]。虽然体内外研究均显示,包括H2O2在内的活性氧簇(reactive oxidative species,ROS)等炎症因子可能是引起子痫前期内皮细胞损伤和功能紊乱的关键因素,本课题组的前期研究结果也证实,子痫前期患者血浆中有较高水平的ROS;但抗氧化剂用于预防和治疗子痫前期的临床研究结果却存在较大差异[5-7]。因此,深人探讨ROS在子痫前期内皮细胞损伤中的作用,阐明其损伤机制,将为进一步探讨抗氧化治疗在该病预防和治疗中的应用提供基础。由于血清是血管系统中运输各种损伤因子的载体,其可能对内皮细胞具有直接的损伤作用。本研究探讨重度子痫前期患者血清对血管内皮细胞的氧化性损伤及抗氧化剂过氧化氢酶的保护作用。

材料与方法

一、材料来源

1.主要材料:人脐静脉帆管内皮细胞(human umbilical vein endothelial ccll,HUVEC)2代末期冻存细胞、HUVEC专用培养基M200购自美国Cdscade公司。若丹明123及Ca2+荧光探针Fluo-4购自美国Sigma公司,二氯双氢荧光素二乙酸酯(2′，7′-dichlorodihydrofluoresceindiacetate,H2DCFDA)购自美国Molecular Probes公司,过氧化氢酶、透膜剂毛地黄皂苷(digitonin)购自美国Sigma公司。藻红蛋白标记的抗人凋亡相关蛋白AP02.7(APO2.7是相对分子质量为38OO0的线粒体膜蛋白,是检测细胞凋亡的特异性指标)购自美国BD公司。

 2.病例选择和血清标本的采集:重度子痫前期患者及血压正常、孕周相近的健康孕妇各26例,来源于蚌埠市第二人民医院及蚌埠医学院第一附属医院,均在符合知情同意及伦理规范条件下采集标本。重度子痫前期的诊断标准依据乐杰主编的《妇产科学》(第6版)⊙ 重度子痫前期患者及健康孕妇均无任何基础疾病史,采样前1个月内均无感染史和用药史。重度子痫前期患者的平均年龄为28岁(23~ 37岁)、平均孕周为36周(33~40周),健康孕妇的平均年龄为32岁(21~34岁)、平均孕周为33周 (27~40周),两者年龄及孕周比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。采集到的非抗凝淑室温放置, 自然析出并小心吸取血清加人干净的EP管中,立即置-70℃ 冰箱保存各用。

二、方法

 l,HUVEC损伤的透射电镜观察:传代至3~ 4代的HUⅤ EC在培养瓶中培养至铺满70%~80% 后,去除培养基,加人3ml消化液洗涤细胞后吸去 2ml,剩余1ml消化液室温消化2~3min;倒置显微镜下观察,待细胞变圆后,轻敲瓶壁3~5次使细胞从瓶壁脱落;加入3ml含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基终止,将细胞转移至离心管中,室温 180g离心6min,去除上清液并加入1mlM200培养基重悬后,调整细胞浓度为2× 10的5次方个/ml。将 HUVEC按4× 10的5次方个/孔力口入6孔板中,37℃ 、5% C02培养箱培养24h后,分别进行如下处理并分组:20%健康孕妇血清刺激(正常血清组)、20%重度子痫前期患者血清刺激(PE组)、20%重度子痫前期患者血清+3× 10的3次方U/ml过氧化氢酶共同刺激 (PE+Cat组),并设置空白对照组(未予任何刺激的细胞)。继续无血清培养基条件下培养24h,消化细胞,戊二醛固定后,进行包埋和切片,透射电镜下观察细胞的凋亡形态、细胞膜和线粒体损伤情况。

 2.检测HUVEC中AP02.7的表达:HUVEC按方法1进行分组处理后,继续无血清培养基培养 24h,之后去除上清液并消化细胞。加人抗 AP02.⒎藻红蛋白抗体进行细胞内染色:加100ul毛地黄皂昔,冰浴20min,用冷PBSF溶液(含2.5%胎牛血清和0,01%NaN3的磷酸盐缓冲液)洗涤1遍,加20ul抗AP02.⒎藻红蛋白抗体,震荡混匀, 室温避光孵育15min,用冷PBSF溶液再洗l遍,弃去上清液,200ul PBSF溶液重悬细胞,避光,用流式细胞仪检测AP02.7的表达情况G

3.HUVEC胞内ROS、Ca2+和线粒体膜电位水平的检测:HUVEC以4× 10的5次方个/孔加入装有无菌圆形盖玻片的6孔板中,37℃、5%CO2培养箱培养24h后,将培养板中的培养基吸净,以缓冲液(pH值为 7.4)洗涤3次后,分别加入4umol/L H2DCFDA、 1umol/L Fluo-4或6umol/L若丹明123,37℃ 、5%C02培养箱中孵育30min后去除负载液,再以缓冲液洗涤3次,加入1ml缓冲液,37℃ 、5%C02培养箱中继续孵育30min。负载探针的HUVEC进行如下分组处理:加入100umol/LH202(阳性对照组)、正常血清组(同上)、PE组(同上)、PE十Cat组(同 L)。细胞在分别给予相应刺激剂的同时,进行激光共聚焦显微镜扫描,物镜为plan apo× 20/0.75 NA,激光发生器功率30uW,激发光波长488nm, 发射光波长为515nm,获取图像的曝光时问150ms; 观测方式:时间序列(time series)程序下对细胞XY 平面进行间隔扫描,快门间隔为15s,对单个视野中的细胞观测120s。以未加血清刺激时的荧光强度为基础值,计算平均荧光强度变化幅度(即基础荧光强度值减去血清刺激后的峰值),以此代表胞内 ROS、Ca2+水平的变化。每次扫描时预先获取基础值2O帧后再加人血清刺激。另于扫描廾始前及结束时问点拍照,观察比较线粒体膜电位的变化。

三、统计学方法

采用Prism4.0软件进行统计分析,测定结果以 x± s表示。其中两组独立样本之间的比较采用独立样本t检验。

结 果

一、HUⅤEC损伤的透射电镜观察结果

与空白对照组、正常血清组的HUVEC比较,PE 组的HUVEC可见:(1)细胞膜脱落,并包裹细胞质形成自噬体;(2)线粒体形态改变,出现水肿,嵴减少或消失;(3)细胞核形态改变,核固缩甚至崩解。PE十Cat组的HUVEC虽然线粒体有轻度水肿表现, 但嵴清晰可见,细胞核形态基本正常,细胞损伤明显改善。见图1。

二、HUVEC中AP02,7表达的变化

与空白对照组[(13.4± 1.1)%]、正常血清组的HUVEC[(13.5± 1.5)%]比较,PE组的HUVEC 中AP02.7的表达率[(37.8± 1.l)%]显著升高, 分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01);而同时加人20%重度子痫前期患者血清及过氧化氢酶可显著抑制重度子痫前期患者血清刺激的AP027表达率,为(19.2± 1.6)%,与PE组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。

三、HUVEC胞内ROS水平的变化

激光共聚焦显微镜扫描显示,阳性对照组的 HUVEC在加入100umol/LH202后导致胞内ROS的荧光强度在极短时间内发生了急剧变化,但PE 组的胞内ROS荧光强度曲线变化相对平缓,而正常血清组和PE+Cat组的胞内ROS荧光强度曲线变化不明显。各组HUVEC胞内ROS荧光强度变化幅度分别为:阳性对照组为31.6± 0.7,正常血清组为 1.1 ±0.4,PE组为12.0± 1.3,PE+CaL组为1,5± 0.5;其中,PE组分别与正常血清组、PE+Cat组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。

四、HUVEC胞内Ca2+水平的变化

不同血清刺激下HUVEC胞内Ca2+荧光强度变化幅度分别为:阳性对照组为7.8± 03,正常血清组为0.6± 0.4,PE组为4.1 ±0.7,PE十Cat组为 0.9± 0.5;其中,PE组分别与正常血清组、PE+Cat组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。激光共聚焦显微镜扫描曲线可见,阳性对照组的HUVEC 在加人100umo1/LH202后导致胞内Ca2+的荧光强度短时间内发生了急剧变化,PE组的变化曲线相对平缓,而正常血清组和PE+C甜组的胞内Ca2+荧光强度曲线变化不明显。

五、HUVEC线粒体膜电位的变化

激光共聚焦显微镜在单个细胞水平实时动态扫描120s后,阳性对照组HUVEC线粒体膜电位在短时间内急剧降低,细胞在0s时荧光信号强,线粒体呈典型棒状结构,至120s时荧光信号变弱,线粒体的棒状结构变得模糊不清;与正常血清组和PE+ Cat组比较,PE组HUVEC线粒体膜电位在相同时间内荧光强度也发生显著变化,而前两组在0s和刺激后120s的荧光强度无显著差别。见图2。

讨 论

子痫前期患者,其血清中高水平的炎症性细胞因子(肿瘤坏死因子α等)、来自胎盘组织的细胞碎片及氧化型低密度脂蛋白等均可刺激血管内皮细胞产生ROS,引发血管炎症或损伤:⒏ m~。本研究结果证实,作为上述各种损伤因子的运输载体,重度子痫前期患者血清可促进内皮细胞产生ROS,介导内皮细胞的氧化性损伤。过氧化氢酶等一系列代谢酶可严格调控血管内皮细胞膜型还原型辅酶I(NADH)或还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶来源的ROS处于正常生理水平[11-12] 。增加m管内皮细胞胞内过氧化氢酶的表达可以显著抑制外源性或内生性ROS 的生理效应,而外源性加人过氧化氢酶也可以显著降低血管内皮细胞生长囚子(VEGF)诱导的 HUVEC胞内ROS水平[13-14]。本研究中,外源性过氧化氢酶有可能通过降低NADPH氧化酶来源的 ROS水平,保护子痫前期患者血清对血管内皮细胞的氧化性损伤。先前也有研究发现,子痫前期患者血清虽可上调HUVEC中血管收缩因子内皮素1(endothelin-1, ET-1)的表达水平,抑制舒张因子N0的合成,但对细胞的生长和活力并没有显著影响[15]。造成这种结果差异的原因可能包括:血清获取和保存方式的不同;血清的热灭活过程破坏了血清中损伤囚子的活性;血清来源的病例数太少;病例选择标准的差异;细胞损伤检测方法的不同等。本研究将新鲜血液标本置于室温下自然凝集析出血清,以避免离心过程中造成可溶性损伤囚子的丢失;其次,本课题组的前期研究显示,血清中的补体对HUVEC并没有显著的毒性作用,因此,本研究直接采用未灭活血清,避免了热灭活过程中血清损伤囚子的失活。细胞内ROS调节失衡可引发细胞Ca2+稳态改变并改变线粒体膜电位,胞内ROS、Ca2+ 及线粒体膜电位在激活细胞凋亡信号过程中可能具有相互促进,相互调节的关系[16-17]。ROS可通过影响细胞内 Ca2+稳态,参与子痫前期血管内皮细胞功能紊乱等病理过程[18] 。本研究中,重度子痫前期患者血清在显著改变HUVEC胞内ROS的同时,也引起细胞内 Ca2+水平显著升高及线粒体膜电位的降低,但过氧化氢酶可明显抑制上述效应。因此推测,HUVEC胞内升高的ROS可能是通过引发细胞Ca2+超载及线粒体膜电位降低而诱导HUVEC损伤。本研究中, 透射电镜下能明显观察到重度子痫前期患者血清造成HUVEC线粒体的水肿,也证实了上述推测。 ROS所致胞内浓度升高的Ca2+可作为凋亡信号启动细胞凋亡,或通过破坏细胞自稳态使凋亡效应系统的关键成分与细胞基质接触,触发凋亡。研究显示,各种因素诱导的细胞凋亡均可出现线粒体功能紊乱,尤其是线粒体膜电位的破坏[19]。ROS既是细胞凋亡过程中促发和加速线粒体膜通透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP) 开放的重要效应分子,又是MPTP开放的产物,这种正反馈机制使MPTP开放具有自我放大效应和 “ 全或无 ” 的特点,导致线粒体膜电位的下降而进人不可逆的过程,最终发生细胞凋亡[20]。

本研究结果证实,重度子痫前期患者血清可通过促进ROS的生成、诱发血管内皮细胞Ca2+超载、破坏线粒体膜电位等机制造成血管内皮细胞的氧化性损伤,为抗氧化剂在预防和治疗子痫前期中的应用提供了进一步的实验依据。但维生素C、E等抗氧化剂应用于预防和治疗子痫前期的临床研究,不同研究得出的结果尚存在较大差异[21] 。一般认为, 这些临床研究结果的相互矛盾可能恰恰反映了体内 ROS的双重生理特性,即在高浓度时ROS可能具有促进细胞凋亡等病理性效应,但低浓度ROS也是细胞正常生理功能所必需的信号分子,过量预防性补充抗氧化剂有可能会干扰ROS的正常生理功能。此外,维生素C、E这些人工合成的抗氧化剂是否具有天然抗氧化剂的生物学效应,以及其在体内的毒性等也可能影响临床研究的结果。因此,有关抗氧化剂的剂量、干预时间及抗氧化剂种类的选择等还有待进一步的研究。

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