槲皮素对子宫颈癌细胞中乙酰肝素酶表达的影响

宫颈癌在全球恶性肿瘤中发病率居第2位,病死率居第4位;在发展中国家,其发病率和病死率均为第2位,全世界每年有25万例患者死于宫颈癌[1]。近年来,宫颈癌的发病趋于年轻化,肿瘤的复发、转移是导致宫颈癌患者死亡的主要原因。化疗药物虽能有效抑制肿瘤细胞的生长和转移,但副反应大,易耐药,因而成为宫颈癌治疗失败的原因之一。因此,寻找高效低毒的抗肿瘤药物至关重要。目前已有研究表明,多种中药具有抗肿瘤特性[2]。因此,研究中药及其有效成分在肿瘤治疗中的作用及其机制,将为肿瘤治疗开辟新的途径。

槲皮素属黄酮类化合物,广泛分布于多种植物的花、叶和果实中,尤以豆科植物槐的干燥花蕾为甚。槲皮素的化学结构稳定,易于分离提纯,且几乎无毒性,囚其强抗氧化性和抗癌功效[3],多年来受到广泛关注。在美国,槲皮素已经作为非处方药用于前列腺癌的治疗,但槲皮素抑制恶性肿瘤的机制尚不完全明确。大量实验证实,乙酰肝素酶(HPA) 是肿瘤细胞扩散和转移过程中的一个关键酶「4」,是惟一能裂解细胞基底膜的内切酶,能削弱细胞间质的屏障功能,促进肿瘤细胞侵人基质和血管壁,与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关,囚而成为抗恶性肿瘤研究的新靶点。本研究旨在探讨槲皮素对宫颈癌 HeLa、Caski细胞中HPA的表达是否具有抑制作用, 为临床应用槲皮素治疗宫颈癌提供理论依据。

材料与方法

一、材料来源

 1.细胞系:宫颈鳞癌细胞系HeLa和宫颈腺癌细胞系Caski均购于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)。

2.主要试剂和仪器:槲皮素购自美国Sigma公司(批号2548746,10/支),HPA1抗体购自美国 Santa Cruz公司(批号f2309,200ug/ml),实时定量 PCR检测试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司,引物由美国Invitrogen公司合成,辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG购自美国KPL公司。TE2000型倒置荧光显微镜为日本Nikon公司产品,实时定量PCR仪为杭州博日科技有限公司产品。

二、方法

 1.细胞培养:HeLa及Caski细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基培养后,置于37℃、 5%C02饱和湿度的培养箱中,2~3d更换培养基。当细胞密度培养至50%左右时进行免疫荧光法检测,培养至90%以上时进行实时定量PCR技术及蛋白印迹法检测HPA mRNA及蛋白的表达。

 2.免疫荧光法检测HeLa、Caski细胞中HPA蛋白的表达:6孔板内放置灭菌盖玻片,将HeLa和Caski细胞悬液滴加至盖玻片上,加21ml含10%小牛血清的RPMI 1640培养基,置5%C02、37℃ 环境培养约8h。用4%多聚甲醛固定后破膜,室温孵育10min。每张切片加人50ul稀释的HPAl抗体覆盖,4℃ 过夜后每张切片加100ul山羊抗兔坨G,避光室温下孵育45min。避光磷酸盐缓冲液(PBS)洗 3次,每张切片加50~100ul的4′-6′二脒基-2-苯基吲哚盐酸(DAPI),室温下避光孵育10min。切片稍干后用抗荧光淬灭封片剂封片,4℃ 避光保存。倒置荧光显微镜下观察HPA在HeLa和Caski细胞中的表达情况,以细胞核、细胞质中出现红色荧光者为阳性表达。

 3实验分组:共分为3组:(1)槲皮素组:槲皮素用二甲基亚砜(DMS0)配制,浓度分别为20、40、 80umol/L,在HeLa、Caski细胞中分别加人含上述浓度槲皮素的RPMI 1640培养基。(2)阳性对照组,用沉默HPA的小分子RNA(siRNA,浓度为 1ug/L)转染HeLa、Caski细胞;siRNA序列,上游:CACCCCGAGAACACTACCAGAAATTCAAGACGTCTGGTAGTGTCTCGGTTTTTTG,下游:AGCTCAAAAA ACCGAGAACACTACCAGAAACGTCTTGAATTCTGGTAGTGTTCTCGG。细胞转染后加入RPMI1640培养基。(3)空白对照组:在HeLa、Caski细胞中仅加人RPMI1640培养基。

4.实时定量PCR技术检测HeLa、Caski细胞中 HPA mRNA的表达:HPA引物序列,上游:5′ - TCATCAATGGGTCGCAGTT-3′ ,下游:5′ -GCTCTTCA GCATCTTAGCCGT-3′ ,扩增片段长度为138bp;以 β肌动蛋白(β -actin)作为内参照,其引物序列,上游: 5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3′ , 下游: 5′ -TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′ ,扩土曾片段长度为 l8O bp。槲皮素组、阳性对照组及空白对照组细胞分别培养24、48、72h后,用TRIzo1法提取细胞总 RNA,按照实时定量PCR检测试剂盒说明书,在反应系统中加人总RNA2鹏,42℃ 30min、80℃5min,将mRNA逆转录成cDNA。PCR反应条件为:95℃ 预变性1min;95℃变性15s,58℃ 退火20s,72℃ 延伸20s,循环40次;72℃ 延伸5min终止反应。实时定量PCR反应结束后,采用SLAN荧光定量PCR检测系统(上海宏石医疗科技有限公司)分析PCR获得的熔解曲线和扩增曲线结果的可靠性并设定循环阈值(⒍ ),以2ΔΔu[5]计算HPAmRNA的相对表达水平。各组均设3个复孔,实验重复3次。

 5.蛋白印迹法检测HeLa、Caski细胞中HPA蛋白的表达:阳性对照组细胞转染后培养48h,槲皮素组及空白对照组细胞分别培养24 、48、72h,3组细胞均用枸橼酸盐缓冲液(TBS)冲洗3次,加人细胞总蛋白提取剂于培养板处理5min,冰浴30min使细胞充分裂解,12O00g、4℃ 离心5min,收集上清液即为总蛋白液,采用Bradford法测定总蛋白浓度,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,200mA转膜1h,用5%脱脂牛奶封闭1h,加入 HPA1兔抗人(1:150,4℃16h),HRP标记的山羊抗兔IgG(⒈ 3000,2h),洗膜,置Ⅹ光片夹中曝光,显影、定影。将胶片进行扫描,采用AlphaEase软件 (美国Alpha Innotech公司产品)分析各条带的吸光度(A)值,以β-actin作为内参照,HPA蛋白的A值/ β-acun的A值表示HPA蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

三、统计学方法

采用SPSS13.0进行统计学处理。计量资料以x±s表示,多组间比较采用方差分析。

结 果

—、HeLa和Caski细胞中HPA蛋白的表达免疫荧光法检测显示,HeLa和Caski细胞中均有HPA蛋白的表达,呈红色荧光,均位于细胞核与细胞质中。见图1。

二、槲皮素处理后HeLa和Caski细胞中HPAmRNA表达的变化

1.HeLa细胞:实时定量PCR技术检测显示,槲皮素组HeLa细胞中HPA mRNA的表达水平随槲皮素浓度(分别为29 、40、80umol/L)的升高而明显下降(P<0.01),呈浓度依赖性。与空白对照组比较, 槲皮素组中20umo1/L的槲皮素处理后HeLa细胞中HPA mRNA表达水平无明显变化(P=0.054); 而40、80umol/L的槲皮素处理后HeLa细胞中 HPA mRNA表达水平明显下降(P=0.050,P= 0.OO0)。与阳性对照组相比较,槲皮素组中20 、40umol/L的槲皮素处理后HeLa细胞中HPA mRNA表达水平明显升高(P=0.OO1);而80umol/L 的槲皮素处理后HeLa细胞中HPA mRNA表达水平无明显变化(P=0.060)。阳性对照组HeLa细胞中 HPA mRNA表达水平明显低于空白对照组(P= 0.OO2)。槲皮素组及阳性对照组HeLa细胞巾HPA mRNA的相对表达水平随着处理时间(分别为24、48、72h)的延长也明显下降(P<0.01),呈时间依赖性;阳性对照组随着处理时间的延长也有明显下降(P=0.OO1),但处理时间为72h与娲h相比无明显下降(P=0.482);空白对照组HeLa细胞随着处理时间的延长无明显变化(P=0.377)。见表1。

 2.Caski细胞:实时定量PCR技术检测显示,槲皮素组Caski细胞中HPA mRNA的表达水平随槲皮素浓度(分别为20、40、80umol/L)的升高而明显下降(P<0.01),呈浓度依赖性。与空白对照组比较, 槲皮素组(包括各浓度处理者)Caski细胞中HPA mRNA的表达水平明显下降(P值分别为0.012、0.002、0.001);与阳性对照组比较,槲皮素组(包括各浓度处理者)Caski细胞中HPA mRNA的表达水平明显升高(P均=0.OO1)。阳性对照组Caski细胞中HPA mRNA表达水平明显低于空白对照组 (P=0.OO0)。3组Caski细胞中HPA mRNA的表达水平随着处理时间(分别为20 、48、72 h)的延长明显下降(P值分别为0.OO1、0.O21、0.032),呈时间依赖性。见表1。

三、槲皮素处理后HeLa和Caski细胞中HPA 蛋白表达的变化

1.HeLa细胞:蛋白印迹法检测显示,槲皮素组 HeLa细胞中HPA蛋白的相对表达水平随槲皮素浓度(分别为20 、40、80umol/L)的升高而明显下降 (P<0.01),呈浓度依赖性。与空白对照组比较,槲皮素组中20umol/L的槲皮素处理后HeLa细胞中HPA蛋白的表达水平无明显变化(P=0.099);而细40、80 um1/L的槲皮素处理后HeLa细胞中HPA 蛋白的表达水平明显下降(P=0。⒆0,P=0.OO7)。与阳性对照组比较,槲皮素组(包括各浓度处理者) HeLa细胞中HPA蛋白的表达水平无明显变化 (P值分别为0.078,0.290,0.594)。阳性对照组 Hela细胞中HPA蛋白的表达水平明显低于空白对照组相(P=0.OO5)。槲皮素组HeLa细胞中HPA 蛋白的相对表达水平随着处理时间(分别为24、48、 72h)的延长也明显下降(P<0.05),呈时间依赖性。槲皮素组当槲皮素处理时间为72h、浓度为 80 umol/L时 ,其与阳性对照组HeLa细胞中HPA 蛋白的相对表达水平相当(P=0.594),几乎不表达 HPA蛋白。见表2。

2.Caski细胞:蛋白印迹法检测显示,槲皮素组 Caski细胞中HPA蛋白的表达水平随槲皮素浓度 (分别为⒛、硐、80umol/L)的升高、处理时间(分别为24、48、72h)的延长均明显降低(P<0.01),呈浓度和时间依赖性。与空白对照组比较,槲皮素组中20 umol/L的槲皮素处理后Caski细胞中HPA蛋白的表达水平无明显变化(P=0.231);而40、80umo1/L的槲皮素处理后Caski细胞中HPA蛋白的表达水平明显下降(P=0,O09,P=0.OO4)。槲皮素组当槲皮素处理时间为72h、浓度为80umo1/L 时,其与阳性对照组Caski细胞中HPA蛋白的表达水平相当(P=0.728),均几乎不表达HPA蛋白。

讨 论

一、宫颈癌与HPA的关系

近年来,宫颈癌的发病率有所上升,这可能与普及宫颈癌的筛查有关。宫颈癌的侵袭和转移仍是中晚期患者治疗失败和死亡的主要原因。一般认为, 细胞增殖活性是肿瘤侵袭、转移的基础和前提,但侵袭与转移的实现还取决于肿瘤细胞对正常组织的破坏能力。细胞外基质是肿瘤侵袭和转移的天然屏障,主要成分是结构蛋白和蛋白多糖等。肿瘤细胞扩散和转移的两个关键步骤是对细胞外基质和基底膜的侵袭破坏以及新生血管的形成。硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是细胞外基质的主要成分,HPA 是人体内惟一能够降解HSPG的内切酶,在肿瘤细胞的侵袭、转移及肿瘤血管生成等过程中起着极其重要的作用]4]。1999年,Ⅵodavsky等[6]成功地进行了HPA的纯化,并克隆出HPA基因。

Zheng等[7] 报道的HPA在多种恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢上皮性癌、子宫内膜癌等细胞中高表达。Shinyo等[8]首次证实了HPA表达于进展期宫颈癌组织,而在正常宫颈组织中无表达;在有淋巴盹管浸润的宫颈癌组织中高表达。⒛09年,Varchalama 等[9]发现,HPA在宫颈癌组织中表达强度明显高于宫颈上皮内瘤变(CIN)和正常宫颈组织,随着宫颈病变的进展其表达增强,尤其在具有淋巴血管浸润和肿瘤较大的宫颈癌组织中呈强阳性表达。本研究证实,HPA在HeLa和Caski细胞中均有表达。 Zhang等[10]报道,HPA蛋白中多抗原肽2(MAP2 ) 的过度表达与胃癌的侵袭、转移及预后有相关性。Shinyo等[8] 还发现,宫颈癌组织中微血管数与HPA表达呈正相关;HPA有表达与无表达的宫颈癌患者相比,其生命质量下降、总生存时间明显缩短,并认为HPA可作为影响宫颈癌患者生存时间的独立因素。因此,HPA将有可能成为宫颈癌治疗及监测的新靶'氪。

二、槲皮素的抗癌机制

槲皮素及其衍生物是自然界分布最广的类黄酮化合物,具有抗氧化、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多方面的药理作用。在体外槲皮素能抑制多种恶性肿瘤细胞的生长。有研究认为,槲皮素是已知最强的抗癌药物之一,能在毫摩尔浓度水平抑制癌细胞增殖。目前,已有多种研究发现,槲皮素通过下调基因表达、抑制信号传导通路、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、逆转肿瘤细胞耐药性并增加其敏感性等途径抑制肿瘤细胞的增殖。但槲皮素抗肿瘤尤其是抑制肿瘤细胞侵袭和转移的机制仍是目前槲皮素从基础研究到临床应用的过程中需要解决的关键问题。

三、槲皮素对宫颈癌细胞中HPA基因表达的影响

槲皮素抑制HPA mRNA的表达可能与槲皮素能够下调某些基囚表达有关,如btl-2、bcl-x、ras基因等[11];另有研究表明,槲皮素抑制结肠癌细胞生长的可能机制是通过下调ErbB2和E1rbB3及蛋白激酶B信号传导通路[12]。

本研究表明,槲皮素以时间和浓度依赖方式抑制HPA mRNA的表达。在HeLa细胞中,低浓度 (20umol/L)槲皮素对HPA mRNA表达的抑制作用不明显,且随着处理时间的延长,这种抑制作用仍然达不到沉默HPA基因后的效果;而高浓度 (80umol/L)槲皮素对HPAmRNA表达的抑制作用明显增强,且随着时间的延长其抑制作用也明显增强,在72h时达到沉默HPA基因的阳性对照组对 HPA血RNA表达的抑制水平。而在Caski细胞中, 各浓度(分别为⒛ 、细、80umd/L)的槲皮素对HPA mRNA均有抑制作用,且均随着处理时间的延长其抑制作用明显增强,到72h时达到最强,但仍达不到沉默HPA基因的阳性对照组对HPA mRNA的抑制水平。可见,槲皮素对HeLa细胞中HPA基因表达的抑制作用强于Caski细胞。HeLa为宫颈鳞癌细胞系(HPV18阳性),Cash为宫颈腺癌细胞系 (HPV 16阳性),槲皮素对两种不同组织类型的细胞中HPA基因的抑制作用不同,其具体机制有待进一步研究。

槲皮素抑制HPA蛋白的表达可能主要与其抑制HPA mRNA的表达有关。本研究中,在HeLa和 Cash细胞中,低浓度(20umol/L)槲皮素对HPA蛋白的抑制作用均不明显,而较高浓度(40、80umo1/L) 的槲皮素显著抑制HPA蛋白的表达;当处理时问为 72h、浓度为80umol/L时,槲皮素对两种细胞中HPA蛋白表达的抑制作用与沉默HPA基因的阳性对照组相当。在Caski细胞中,槲皮素对HPA mRNA表达的抑制作用弱于HeLa细胞,但对HPA 蛋白的抑制作用与HeLa细胞无明显差异,其机制可能为HPA蛋白表达并非由HPA mRNA表达所决定,槲皮素可能直接作用于HPA蛋白,诱导HPA蛋白降解,槲皮素降解产物对HPA蛋白表达影响的具体机制有待进一步研究。

综上所述,本研究证实,槲皮素在转录及蛋白水平均能有效抑制HPA的表达,为槲皮素在体内抑制宫颈癌细胞生长提供了理论依据,也为宫颈癌的治疗与监测开辟了新途径。

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