Foxp3和RORγt基因在子痫前期患者外周血单个核细胞中的表达

子痫前期是妊娠期特有的疾病,其病囚和发病机制尚不明确,其病因学说中的免疫学说是多年来研究的热点。日前,有关辅助性T淋巴细胞(Th)17与调节性T淋巴细胞 (Treg)在妊娠过程中的研究多局限于在复发性白然流产中的作用[1-2] ,而两者在子痫前期发病过程中的相关研究较少[3-4],且未达成共识。类视黄醇相关孤儿受体yt(retinoid-related orphan rcccptor yt,RORyt)为Th17细胞特有的转录囚子[5],叉头蛋白3(FoxP3)是Treg细胞的特性核转录因子[6]。本研究通过比较健康孕妇与重度子痫前期孕妇外周血单个核细胞([peripheralblood mononuclear cell,PBMC)中 Th17和Treg细胞的特异性转录因子RORyt和Foxp3mRNA的表达,探讨其在子痫前期发生中的作用和意义。

 — 、资料与方法

1资料来源:2011年9月至2012年3月期间在山西医科大学第一医院住院的孕妇60例,其中重度子痫前期孕妇与健康孕妇各30例。重度子痫前期的诊断标准参照《妇产科学》(第7版),选取的观察对象既往均无自身免疫性疾病。

2主要材利:人淋巴细胞分离液(北京索莱宝科技有限公司提供),总RNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司产品),β 肌动蛋白(β -actin)、Foxp3和RORyt基因的引物由上海生工生物I程技术服务有限公司合成,逆转录试剂盒(美国Fermentaq公司产品),SYBR Green I荧光定量PCR试剂盒(美国Roche公司产品)。

3标本采集与处理:所有孕妇均于人院时抽取肘静脉血4ml,置于抗凝管中,用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释抗凝血。取淋巴细胞分离液于离心管中,将稀释血液沿管壁缓慢加至分离液上面。按照常规淋巴细胞分层液密度梯度离心 20min,吸取上面第2层灰白色膜状物,以PBS洗涤2遍,分离得到PBMC,-80℃冰箱保存,待提取总 RNA。

4方法:总RNA提取:取PBMC5× 106个,加入1ml TRIzod试剂提取RNA。加人氯仿,再4℃ 离心5min并将上清液移人另一EP管中,加人等体积异丙醇室温放置5min,4℃ 离心min以沉淀RNA,用70%乙醇洗涤沉淀2次,4℃ 离心2min,EP管底部可得到RNA沉淀,用50ul 0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解后作为逆转录(RT)的模板。RT反应条件:11ul RNA(即1ug),02 ug/ml随利1 ul, 65℃孵育5min;加人4ul缓冲液,10mmoL/L三磷酸脱氧核苷(dNTP)3 ul,1 ul RNA酶抑芾蛴刂和20U/ul RT酶1 ul, 25℃ 孵育10min、42℃孵育1h、72 ℃孵育15min。实时 (real-time)PCR反应体系:荧光染料校正液FastStart Universal SYBR Green Master 10ul,15umol/L上、下游引物各0.5ul,cDNA2ul,无DNA酶和RNA酶的水7ul,共 20ul:PCR反应条件94%℃预变性10min;94℃ 15s,60℃ 60s,45个循环结束。见表1。

5采用荧光定量PCR技术检测FoxP3和RORYt mRNA的表达水平:PCR反应结束后对所扩增的PCR产物熔解曲线进行分析,荧光定量PCR仪读取循环阈值(cyc1e threshold,Ct),首先计算各样本测定基因Ct值与内对照β- actin基因Ct值的差值ΔCt,再用各实验组样本的ΔCt减去正常对照样本的ΔCt,得到ΔΔCt,采用2ΔΔ法进行计算,表示实验组测定基囚相对的表达水平。

 6统计学方法:应用SPSS16.0软件处理数据,实验结果以x± s表示,均数的比较采用两独立样本t检验。相关性分析采用Pearson积差相关。

二、结果

1.孕妇PBMC中Foxp3和RORyt mRNA的表达水平: Foxp3 基因、RORyt基因和随机标本β-actin基因的扩增产物熔解曲线峰值分别在82.5、86.5、87.0,且熔解曲线均为单峰,即扩增产物单一。Foxp3 mRNA在重度子痫前期患者 PBMC中的表达减弱,其表达水平重度子痫前期患者与健康孕妇比较,差异有统计学意义(P<0.01)。RORyt mRNA在重度子痫前期患者PBMC中的表达水平增高,重度子痫前期患者与健康孕妇比较,差异有统计学意义(P<001)。 RORyt mRNA/FoxP3 mRNA表达水平比值在重度子痫前期患者中增大(为4.3± 4.1),且重度子痫前期患者与健康孕妇(为0.9± 0.6)比较,差异有统计学意义(P<0.01)见表2。

2孕妇RORyt mRNA与Fpxp3mRNA表达水平的相关性:所有孕妇PBMC中RORyt mRNA与Foxpp3 mRNA的表达水平总体上呈负相关(r=-0.725,P<0.01)。其中健康孕妇RORyt mRNA与Foxp3 mRNA表达水平的相关系数无统计学意义(r=-0.344,P=0.062),但重度子痫前期孕妇中呈负相关(r=0.764,P<0.01)。

三、讨论

近年来,关于妊娠期高血压疾病的发病机制从免疫机制、胎盘浅着床、血管内皮细胞损伤、遗传囚素、营养缺乏、胰岛素抵抗等方面进行F研究,病因学说有多种,其中免疫学说是近年来研究的热点,并较多涉及Th1/Th2失衡理论。目前,随着对CD+ T淋巴细胞研究的深人,已明确初始CD+T 淋巴细胞在不同的细胞囚子及环境作用下可分化为功能不同的细胞,如Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、CD4+ CD25+ Treg 细胞等。Th17细胞和Treg细胞是近年研究发现的与Th1、T2细胞完仝不同的CD4+ T细胞系,具有独立的分化和调节机制[7-8]。Th17细胞和Treg细胞是一对关联的T淋巴细胞亚群, Th17细胞是具有促炎作用的T淋巴细胞亚群,Tl喟细胞是具有抑炎作用的T淋巴细胞亚群,共同参与维持体内免疫功能的动态平衡[9]。Th17/Treg细胞功能失衡与自身免疫性疾病、感染性疾病、过敏性疾病、恶性肿瘤、移植排斥等多种重大疾病的发生发展及治疗有密切关系。已有研究发现,在过敏性哮喘、过敏性紫癜、AIDS、系统性红斑狼疮、IgA肾病等疾病中Th17/Treg处于功能失衡状态,且Th17细胞处于优势地位。有关T淋巴细胞的上述4类亚群细胞在正常妊娠及复发性自然流产中的研究提示,正常妊娠可能依赖于 Th1、Th2、Th17及Treg这4种细胞间的平衡,妊娠的成功倾向于Th2和Treg细胞的保护性免疫状态,而Th1、Th17细胞过度表达则可能导致各种妊娠并发症的发生 。

Th17细胞在防御病原体的感染、介导炎性反应、白身免疫性疾病、肿瘤和移植排斥等的发生发展中发挥着重要作用。Treg细胞具有抑制T淋巴细胞及抗原呈递细胞的功能、降低致炎细胞因子的产生及抗体分泌等作用,能够抑制白身免疫性疾病的发生[13],在维持机体免疫内环境平衡方面有重要作用。Treg细胞的减少可直接导致具有免疫抑制效应的细胞(CD4+CD25+ Treg)功能不足和抑制性细胞因子产生减少,从而导致炎症反应失控并引起自身免疫损伤。本研究中,与健康孕妇比较,重度子痫前期患者PBMC中表现为Th17型细胞转录因子RORyt mRNA表达增强,同时Tleg型细胞转录因子Foxp3 mRNA表达减弱,这表明介导炎症反应的Th17细胞增多,抑制炎症反应的Treg细胞减少。

在稳定状态下,免疫系统没有被激活时,转化生长因子β(TGF-β )促进Treg细胞的产牛,抑制炎症,防止自身免疫反应 [14]。在感染环境下,内源性TGF-β与炎症介质白细胞介素(IL)6、1L-2l促进Th17效应细胞的分化,而后随着炎症介质如IL-6 水平的降低,TGF-β又通过扩增、维持Treg细胞的功能,在清除感染后将效应细胞的功能控制在合适状态。人然CD+ T淋巴细胞是分化为Th17细胞还是Treg细胞主要依赖于细胞因子调节Foxp3与RORyt的平衡。Th17和 Treg细胞分化主要是因为不同的转录因子而分化为不同的细胞,即Th17细胞的转录囚子是RORyt,而Treg细胞的转录因子则是Foxp3。Th17/Treg型转录囚子之间是百相作用、互相调节义互相抑制的,对于妊娠而言主耍是其各自浓度和所占比例的大小而影响妊娠的结局,当Th17型转录囚子在整个免疫系统中表达过高时就会导致病理妊娠,本研究中,与健康孕妇比较,Th17型转录因子在重度子痫前期患者中表达增高,RORyt mRNA/Foxp3 mRNA比值在重度子痫前期患者中增大,表明促炎/抑炎细胞Th17/Treg处于免疫失衡状态,Th17处于主导地位。Th17型转录因子在重度子痫前期患者中表达增高,说明在子痫前期的病理妊娠过程中可能起主导作用。

综上所述,在子痫前期的发病过程中,外周血中促炎的Th17细胞因子RORyt增加,而介导免疫耐受的Rreg细胞囚子Foxp3呈现不同程度的降低,导到处Th17/Treg型细胞因子比例失衡,同时也可能造成其他与炎症有关的细胞激活及因子分泌,从而使得机体环境偏向炎症发生发展的过程。总之,在子痫前期患者外周血中Th17/Treg处于免疫失衡状态,其可能是子痫前期的发病机制之一,但也可能是子痫前期发生发展的一种病理表现,这仍需要进一步的研究。

参 考 文 献

[1] Bansal AS. Joining the immunological dots in recurrent miscarriage[J].AmericanJournal of Reproductive Immunology,2010.307-315.

[2] Wang WJ,Hao CF,Yi L. Increased prevalence ofT helper 17 (Thl7) cells inperipheral blood and decidua in unexplained recurrent spontaneous abortionpatients[J].Journal of Reproductive Immunology,2010.164-170.

[3] Saito S. Thl7 cells and regulatory T cells:new light onpathophysiology of preeclampsia[J].lmmunol Cell Biol,2010.615-617.

[4] Brewster JA,Orsi NM,Gopichandran N. Gestational effects on host inflammatory response in normaland pre-eclamptic pregnancies[J].Eur J Obstet Gvnecol ReprodBiol,2008.21-26.

[5] Ivanov Ⅱ,McKenzie BS,Zhou L. The orphan nuclear receptor RORγt directs thedifferentiation program of proinflammatory 1L-17+ T helper cells[J].Cell,2006.1121-1133.

[6] Alatrakchi N,Koziel M. Regulatory T cells and viral liver disease[J].Journalof Viral Hepatitis,2009.223-229.

[7] Park H,Li Z,Yang XO. A distinct lineage ofCD4 T cells regulates tissueinflammation by producing interleukinl7[J].NatureImmunology,2005.1133-1141.

[8] Littman DR,Rudensky AY. Thl7 and regulatory T cells in mediating and restraininginflammation[J].Cell,2010.845-858.

[9] Nistala K,Wedderburn LR. Thl7 and regulatory T cells:rebalancing pro-andanti-inflammatory forces in autoimmune arthritis[J].Rheumatology(Oxford),2009.602-606.

[10] Bettini M,Viqnali DA. Regulatory T cells and inhibitory cytokines in autoimmunity[J].CurrentOpinion in Immunology,2009.612-618.

[11] Sasaki Y,Sakai M,Miyazaki S. Decidual and peripheral blood CD4 + CD25 + regulatory Tcells in early pregnancy subjects and spontaneous abortion cases[J].MolecularHuman Reproduction,2004.347-353.

[12] Muy-Rivera M,Sanchez SE,Vadachkoria S. Transforming growth factor-beta1 (TGF-betal) in plasma isassociated with preeclampsia risk in Peruvian women with systemic inflammation[J].AmericanJournal of Hypertension,2004.334-338.

[13] Sakaquchi S,Ono M,Setoquchi R. Foxp3+ CD25+ CD4+natural regulatory T cells in dominantself-tolerance and autoimmune disease[J].ImmunologicalReviews,2006.8-27.

[14] Chen X,Vodanovic-Jankovic S,Johnson B. Absence of regulatory T cell control of TH1 and TH17 cellsis responsible for the autoimmune-mediated pathology in chronic graft versushost disease[J].Blood,2007.3804-3813.