红景天苷通过HIF1途径对缺氧诱导心肌细胞凋亡的抑制作用
发表时间：2012-03-22 浏览次数：455次
作者：张金平,陈建宗,刘安恒,张娟,贾新 作者单位：第四军医大学西京医院： 中医药研究所中西医结合老年脑病研究室， 心脏内科，陕西 西安 710033
【摘要】 目的: 研究红景天苷(Sal)抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡作用并探讨其可能的分子机制. 方法: 将原代培养的心肌细胞分为6组：正常对照组、缺氧组、缺氧+不同剂量Sal预处理组(10, 50, 100 mg/L)和缺氧+10-7mol/L胰岛素组. 比色法测定细胞存活率、细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)，肌酸激酶(CK)活力;Hoechst 33258染色观察细胞形态学改变;细胞流式检测术、DNAladder测定细胞凋亡;免疫荧光染色、蛋白印迹检测HIF1α表达. 结果: 与缺氧组比较，不同浓度Sal预处理组可增加细胞存活率(P<0.05);显著降低细胞培养上清液LDH，CK活力(P<0.01);减少Hoechst染色阳性细胞(P<0.01);流式细胞仪、DNAladder检测凋亡细胞比率降低. 缺氧可激活HIF1α的表达并诱导其转位，100 g/L Sal可明显增加HIF1α蛋白的表达(P<0.01). 结论: Sal可抑制缺氧诱导的心肌细胞的凋亡，该抑制作用具有剂量依赖性，其分子机制可能与激活HIF1α的表达,诱导其转位有关.
【关键词】 红景天苷,心肌,细胞学,细胞低氧;细胞凋亡;缺氧诱导因子1α
0引言
研究[1]证实，阻断心肌细胞凋亡信号通路可显著减少心肌梗死面积，改善心脏功能. 红景天苷(Salidroside, Sal)为植物红景天的有效萃取物之一，具有抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗衰老等作用. 近年，动物实验及临床观察证实，它还具有保护心肌和抗心律失常[2]的作用，作用机制可能与内源性类阿片活性肽水平的升高以及应激性儿茶酚胺、c磷酸腺苷积聚水平的下降有关[3]. 我们拟通过建立缺氧诱导心肌细胞凋亡模型，观察Sal对心肌细胞凋亡的抑制作用，并从其对缺氧诱导因子(HIF1α)的影响方面探讨其可能的分子机制.
1材料和方法
1.1材料新生1～3 d SD大鼠(第四军医大学实验动物中心);Sal(中国药品生物制品检定所);小牛血清、DMEM低糖培养基(Gibco公司);胶原酶I，噻唑蓝(MTT)，5溴2′脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)，RNase A(美国Sigma公司);乳酸脱氢酶(LDH)测试盒、肌酸激酶(CK)测试盒(南京建成生物工程研究所);Hoechst 33258染料，BCA蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所);蛋白酶K(Merck公司);HIF1α抗体(美国Novus公司);HRP，FITC标记二抗(北京中山生物技术有限公司);其余试剂均为国产分析纯级.
1.2方法
1.2.1心肌细胞原代培养取大鼠心室肌组织并剪碎,胶原酶I分次消化分离心肌细胞. 以含100 mL/L新生牛血清的DMEM低糖培养基制备细胞悬液,差速贴壁后加入100 μmol/L Brd U纯化心肌细胞, 接种细胞于培养板.
1.2.2缺氧模型的建立及实验分组采用Koyama等[4]方法配制缺氧液(mmol/L): NaH2PO4 0.9，NaHCO3 6.0，CaCl2 1.0，MgSO4 1.2，乳酸钠40，HEPES 20，NaCl 98.5，KCl 10.0，pH 6.8, 37℃,以高浓度氮气饱和(>99.9%，1 L/min×30 min),测其血气，PO2≤4.0 kPa. 用缺氧液置换正常培养液，三气培养箱(950 mL/L N2+50 mL/L CO2)缺氧孵育6 h. 将培养的心肌细胞分为6组： ① 正常对照组：用正常培养液培养细胞;② 缺氧组：参照上述方法，建立缺氧模型;③～⑤ 缺氧+不同剂量Sal预处理组：分别用10，50，100 mg/L不同剂量的Sal，24 h预处理细胞，然后参照缺氧方法处理细胞;⑥ 缺氧+1×10-7mol/L胰岛素(Ins)预处理组： 处理参照3～5组，作为阳性药物对照组.
1.2.3心肌细胞生长状态检测细胞处理后用MTT比色试验检测细胞存活率.
1.2.4LDH，CK活性测定取处理后细胞培养上清液，参照LDH,CK测试盒步骤，用分光光度计测定各管吸光度，计算上清中LDH,CK活性.
1.2.5Hoechst 33258染色细胞处理后，经40 g/L多聚甲醛固定，PBS冲洗，5 mg/L Hoechst33258孵育10 min，PBS冲洗并紫外线激发，荧光倒置显微镜下任选5个视野观察计数并拍照.
1.2.6DNA琼脂糖凝胶电泳参照文献[5]方法提取心肌细胞DNA. 配制20 g/L琼脂糖凝胶，加入DNA样品，TBE缓冲液中电泳,凝胶成像系统中成像.
1.2.7细胞流式检测收集处理后细胞PBS清洗，荧光素FITC标记的膜联蛋白V(AnnexinV)和碘化丙啶(PI)双标，利用流式细胞仪测定各组细胞凋亡率.
1.2.8HIF1α免疫荧光染色细胞处理后40 g/L多聚甲醛固定并透化处理，PBS清洗后，100 mL/L羊血清封闭,加入HIF1α一抗4℃过夜孵育. FITC标记的荧光二抗孵育30 min，荧光显微镜下观察细胞并拍照.
1.2.9免疫印迹细胞处理后裂解细胞收集蛋白. 蛋白定量后行SDSPAGE凝胶电泳并转移蛋白至PVDF膜. HIF1α一抗4℃过夜孵育后加入HRP标记二抗37℃孵育1 h，凝胶成像系统ECL发光成像，并用Lab Image version 2.7.1软件分析各组条带.
统计学处理：实验数据以x±s表示，用Graphpad software统计软件进行组与组之间单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义.
2结果
2.1Sal对心肌细胞存活率的影响经MTT比色法检测各组细胞的存活率与正常对照组相比，缺氧组心肌细胞存活率下降至(43±10)%，差异具有统计学意义(P<0.01);10,50,100 mg/L Sal各预处理组心肌细胞缺氧后存活率分别增至(56±15)%,(64±9)%和(67±13)%，与缺氧组比较，差异具有统计学意义(P<0.05);1×10-7mol/L Ins预处理组心肌细胞缺氧后存活率增至(77±11)%，与高浓度Sal预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05).
2.2Sal对Hoechst33258染色的影响Hoechst 33258染色细胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，即凋亡小体的产生(图1B，C箭头). 缺氧组Hoechst染色阳性细胞率明显增加，与正常对照组比较有明显差异(P<0.01);100 mg/L Sal预处理组与1×10-7mol/L Ins预处理组染色阳性细胞率与缺氧组相较明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，而100 mg/L Sal组染色阳性细胞率与1×10-7 mol/L Ins预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05).
A： 正常对照组; B： 缺氧组; C： 缺氧+100 mg/L Sal预处理组.
图1心肌细胞Hoechst 33258染色后细胞形态学改变×200(略)
2.3Sal对心肌细胞培养上清液 LDH，CK活性的影响缺氧组细胞培养上清液中的LDH，CK活力与正常对照组相比较差异有统计学意义(P<0.01,表1);10，50，100 mg/L Sal及1×10-7 mol/L Ins预处理组心肌细胞培养上清液中LDH,CK活力均降低，与缺氧组比较差异有统计学意义(P<0.01). 100 mg/L Sal与Ins预处理组比较差异无统计学意义(P>0.05).
表 1Sal对缺氧心肌细胞培养上清液乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活力的影响(略)
bP<0.01 vs 正常对照; dP<0.01 vs 缺氧. Sal： 红景天苷; Ins： 胰岛素.
2.4Sal对心肌细胞凋亡的影响正常对照组无“ladder”出现(图2)，缺氧组却可见明显特异性的“ladder”出现，而100 mg/L Sal和1×10-7 mol/L Ins预处理组虽有“ladder”出现，但较缺氧组“ladder”的灰度明显降低. 流式细胞仪检测，正常对照组细胞凋亡率为6.25%，缺氧组细胞凋亡率增至55.33%，而10，50，100 mg/L Sal预处理组与1×10-7 mol/L Ins预处理组心肌细胞凋亡率均降低至42.74%，42.35%，37.74%和27.40%.
M: DNA size marker; 1： 正常对照组; 2： 缺氧组; 3： 缺氧+100 mg/L Sal预处理组; 4： 缺氧+1×10-7mol/L Ins预处理组.
图2DNA ladder检测Sal对心肌细胞凋亡的影响(略)
2.5Sal对心肌细胞HIF1α表达的影响缺氧可激活HIF1α的表达(图3)，且诱导HIF1α从胞质到胞核及其核周的转位,100 mg/L Sal预处理后可显著增加细胞中HIF1α的表达. 免疫印迹实验显示，正常培养的心肌细胞中较少有HIF1α的表达，缺氧可激活HIF1α的表达，灰度测定为正常组的9.6倍，与正常对照组相比较差异显著(P<0.01)，1×100 mg/L Sal预处理可激活HIF1α的表达，灰度测定为正常对照组的13.8倍，与缺氧组比较差异具有统计学意义(P<0.01).
A： PBS一抗阴性对照组; B： 正常对照组; C： 缺氧组; D： 缺氧+100 mg/L Sal预处理组.
图3免疫荧光检测Sal对心肌细胞HIF1α表达的影响×200(略)
3讨论
凋亡造成心肌细胞的减少在人类多种类型的心脏疾病中占极其关键地位[6]. 实验结果显示，采用Koyama等[4]的缺氧方法可成功诱导心肌细胞的凋亡，而经10,50,100 mg/L Sal预处理的心肌细胞存活率明显升高，细胞培养上清液LDH，CK活力降低，流式细胞检测凋亡细胞比率、Hoechst染色阳性细胞比率、DNA ladder灰度均明显下降. 结果提示，对缺氧诱导的心肌细胞的凋亡，Sal具有抑制作用，且该抑制作用具有剂量依赖性. 1×10-7mol/L Ins对心肌细胞的凋亡具有明显的抑制作用[7]，与100 mg/L Sal预处理抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡的作用比较无差异.
细胞适应缺氧性环境改变的方式之一，为激活氧敏感性转录因子， HIF1由结构稳定性β亚基和氧依赖性α亚基组成,可防止组织损伤、抑制细胞凋亡和维持机体氧稳态[8]. 在确定Sal对缺氧诱导的心肌细胞的凋亡具有抑制作用的前提下，我们进一步探讨了其可能的分子机制. 结果显示，正常培养的心肌细胞中较少有HIF1α的表达，且表达主要集中在胞质中，这与以往的研究结果一致[9]. 我们推测，Sal抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡的作用可能是通过激活HIF1α的表达并诱导其转位有关[10]. 但Sal对缺氧诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用有待进一步研究. 我们的结果为将Sal开发用于缺氧造成的心脏疾病治疗提供了一定的理论基础.
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