胎盘基底板中玻连蛋白的表达及其与重度子痫前期发病的关系

  子痫前期是一种严重的妊娠合并症,是导致孕产妇及围产儿死亡的主要原因之一。目前,其病囚尚不明确。多认为其发病起源于胎盘的病理生理改变,尤其是胎盘基底板的变化,继发性引起胎盘组织的缺血缺氧,而氧化应激状态扩散至孕妇体循环,导致孕妇血管内皮细胞功能紊乱,凝血与纤溶系统失衡,血压升高、蛋白尿及多脏器功能不全[1]。玻连蛋白(vitronectin,VN)作为黏附蛋白家族中的一员,具有细胞黏附、促进凝血及免疫防御的功能。因而VN可能在重度子痫前期胎盘基底板病理生理改变及其发病机制中起到重要作用。本研究通过检测重度子痫前期孕妇胎盘基底板中ⅤN蛋白及mRNA的表达及凝血功能指标的变化,旨在探讨VN在重度子痫前期发病中的作用,为重度子痫前期孕妇的临床监测及治疗提供新途径。  资料与方法  一、资料来源与分组  随机选择⒛10年3月-2011年12月吉林大学白求恩第二医院产科住院分娩的重度子痫前期孕妇63 例,其中17例早发型重度子痫前期孕妇为早发型重度子痫前期组,平均年龄(29± 6)岁,平均分娩孕周(32.7± 5.1)周;16例晚发型重度子痫前期孕妇为晚发型重度子痫前期组,平均年龄(29±5)岁,平均分娩孕周为(38.6±l.7)周;重度子痫前期的诊断及分类标准参照八年制全国统编教材《妇产科学》2版[2]。早发型重度子痫前期孕妇发病于孕周前,晚发型重度子痫前期孕妇发病于孕34周后。另选孕34周以前的健康孕妇,因胎儿心脏发育畸形等原因要求引产者15例为早期对照组,平均年龄(28± 6)岁,平均孕周为(298± 37)周;孕34周以后的健康孕妇15例为晚期对照组,平均年龄为(30± 4)岁,平均孕周为(385± 14)周。各组均排除合并有慢性高血压、糖尿病、肝肾疾病、甲状腺功能亢进、感染等;各组孕妇均为单胎妊娠,分娩方式除早期对照组中7例经水囊引产外,其余均为硬膜外阻滞下剖宫产分娩。该研究获吉林大学白求恩第二医院伦理委员会批准,标本采集均有孕妇的知情同意。  二、方法  1.胎盘组织标本采集:待胎盘娩出后立即于无菌条件下,随机取距脐带2cm、肉眼观胎盘梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区及远离梗塞区的组织分别各3块,大约10cm× 1.0cm× 0,1cm。1块标本立即用生理盐水漂洗,去除血液并吸干水分,修剪标本后重约50mg,置于-80℃ 冰箱中待测。1块标本置入4%甲醛溶液中,固定24h,常规石蜡包埋、切片、烤片,常温下储存待行免疫组化检测。  2血浆标本采集:孕妇于人院时、治疗前空腹抽取静脉血2 ml,2500 r/min离心10min,4℃ 。取血浆批量上机待测凝血功能。  3.免疫组化法检测VN蛋白表达:兔抗人VN单克隆抗体购自美国abcam公司,工作浓度⒈9~O0。采用北京中杉金桥生物技术有限公司生产的PV-90O0免疫组化试剂盒对胎盘基底板中VN蛋白进行免疫染色。以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照,以已知阳性切片作为阳性对照。用二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)显色,苏木素轻度复染,系列乙醇脱水,二甲苯透明,封片,显微镜下观察并拍照。免疫组化结果判定:采用image-pro plus6.0软件图像分析系统对组织切片进行图像分析,同一组织在高倍镜下分别取5个不同的视野进行吸光度(A)测定,以代表胎盘基底板中VN蛋白的表达水平;于胎盘基底板梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区、远离梗塞区分别于高倍镜下取不同的视野进行平均A测定,以代表VN蛋白的表达水平。  4.RT-PCR技术检测VN mRNA表达:胎盘组织标本中加人蛋白裂解液1ml,浆,TRIzol法提取总RNA。按RT-PCR试剂盒(杭州博日科技有限公司产品)操作步骤提取cDNA,用相关引物扩增得到目的片段。引物设计按文献[3],由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。VN引物序列(254bp)上游:5′ -CCTTCACCGACCTCAAGAAC-3′ ,下游:5′ -GAAGCCGTCAGAGATAmTCG-3′ 。 以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照,其引物序列(177bp)⊥1游:5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′,下游: 5′ -CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′ 。 反应条件:反应体系25 ul,94℃反应30s,55℃ 反应30s,72℃ 延伸1 min。反应30个循环。PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳,并于凝胶成像系统中紫外线透射成像。以VN与GAPDH条带的A比值表示VNmRNA的相对表达水平。  5.凝血功能检测:取枸橼酸钠抗凝的外周血2 ml,2000 r/min离心10min,取血浆上机测定孕妇的凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(RIb)并计算国际标准化比率(INR)。  6.相关性分析:对早发型重度子痫前期组和早期对照组孕妇的凝血功能检测的异常指标,与VN表达水平进行相关性分析。  三、统计学方法  采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。组间比较采用扌检验,对数据进行正态性检验和方差分析,多个独立样本均数比较采用单因素方差分析,最小显著差(LSD)法进行多组间多重比较,相关性分析用spearman相关分析法。  结 果  一、各组胎盘基底板中ⅤN蛋白的定位表达  4组胎盘基底板中均可检测到VN蛋白的表达,在早期及晚期对照组,VN蛋白主要表达于部分形态正常的绒毛外滋养细胞(extravilloustrophoblasts,EVT)胞膜,胞质或胞核中也有一定表达。在早发型及晚发型重度子痫前期组,VN蛋白表达的部位较为广泛,于梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区、远离梗塞区的细胞滋养细胞中均有表达,EVT胞膜、胞质中也有一定表达。尤其在梗塞灶中心非细胞结构坏死组织中呈高表达,而在远离梗塞区组织中呈弱表达。见图1~4。  二、各组胎盘基底板中ⅤN蛋白表达水平  早发型重度子痫前期组胎盘基底板中VN蛋白表达水平最高,为0.152±0,019,晚发型重度子痫前期组为0.113±0.023、晚期对照组为0.0955±0.014、早期对照组为0.055±0.010,各组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。VN蛋白在胎盘基底板梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区组织及远离梗塞区组织中的表达水平依次逐渐降低,分别横向比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。各组梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区组织及远离梗塞区组织中ⅤN蛋白表达水平分别纵向比较,差异均无统计学意义(P>0.05 )。见表1。  三、各组胎盘梗塞灶中心及其周围组织中VNmRNA表达水平  各组胎盘梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区组织、远离梗塞区组织中均可检测到VN mRNA表达,横向比较,早发型重度子痫前期组及早期对照组的梗塞灶中心VN mRNA表达水平较远离梗塞区组织升高,差异有统计学意义(P<0.05)。纵向比较,各组相同部位间的差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。  四、各组孕妇凝m功能指标水平  早发型重度子痫前期组PT明显缩短,与早期对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。而各组APTT、FIb及INR分别比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。  五、早发型重度子痫前期组及旱期对照组VN表达水平与PT的相关性分析  早发型重度子痫前期组胎盘VN表达水平与PT呈显著负相关(r=-0.612,P<0.05);而早期对照组胎盘VN表达水平与PT无相关性(r=0489,P>0.05)。  讨论  一、胎盘基底板巾VN的表达与子痫前期胎盘梗塞的关系随着胎盘的娩出,大多数子痫前期孕妇的临床症状逐渐消失。由此,越来越多的研究者将子痫前期研究的目光投向了胎盘。胎盘功能的建立依赖于良好的胎盘形态和丰富的血液供应[4],这是维持妊娠成功的关键。目前认为,胎盘功能异常及其缺氧导致了作用于孕妇向管的可溶性生物囚子的生成,由此引起了孕妇血管内皮功能障碍和子痫前期的一系列临床症状发生[5]。近年来,对子痫前期孕妇的胎盘病理检查发现,胎盘血管内大量纤维素的沉积造成胎盘螺旋小动脉的栓塞,这与维持正常血液灌流的凝血、抗凝系统失衡有关。VN在国内翻译为外连素、体外连接蛋白、玻璃粘连蛋白或S蛋白,主要参与细胞之间、细胞与细胞间质之问的黏附,这是通过黏附蛋白家族共同的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)3肽结构来实现的,其特舁性受体就是整合素家族。目前鲜见VN在子痫前期胎盘中表达的系统研究。本研究通过对胎盘基底板中VN蛋白表达水平的检测,发现VN在早发型及晚发型重度子痫前期组、早期及晚期对照组孕妇胎盘基底板的梗塞灶中心、梗塞灶边缘、近梗塞区、远离梗塞区的表达水平依次逐渐降低。这些结果提示,胎盘发生梗塞后VN表达水平升高,一方面,VN通过其黏附作用稳定了细胞外基质,减少了纤维蛋白的降解,为胎盘梗塞灶的纤维化提供了有利条件,但这种纤维化则进一步影响了胎盘的灌注。另一方面,这样可以减少胎盘梗塞灶内毒性物质及滋养细胞坏死碎片进入孕妇的血液循环,从而阻止其对孕妇血管内皮及其他器官的损伤,减少临床症状的发生。因此,VN在胎盘梗塞区及近梗塞区的高表达有利于胎盘损伤修复并对孕妇具有一定的保护作用。  二、胎盘基底板中VN的表达与子痫前期孕妇凝血机制的变化  本研究发现,在梗塞灶边缘、近梗塞区及早期梗塞灶的细胞滋养细胞及EVT胞膜、胞质中VN呈强表达;在中期及晚期梗塞灶中心非细胞结构坏死组织中呈强表达。在中期梗塞灶中心见坏死组织的滋养细胞残影,而胎儿血管完整,间隙内游离的红细胞胞膜完整。在晚期梗塞灶中心可见坏死的绒毛残影及被VN抗体染色的纤维状组织。这些结果提示,胎盘梗塞灶中的坏死细胞成分中存在VN,一方面可能参与了局部的凝血和纤维化过程,另一方面可能游离进入孕妇血液循环,从而对健康妊娠过程产生不利的影响。  健康孕妇于孕晚期处于血液的高凝状态,同时抗凝功能和纤溶活性也相应增强,两者保持着高水平的动态平衡,这有利于胎盘剥离后的止血。子痫前期孕妇血管内皮细胞受到严重损伤,伴随着血小板活性和凝血功能显著增强,而抗凝功能和纤溶功能降低,导致凝血-纤溶平衡失调,机体处于病理性高凝状态并具血栓形成倾向,此是子痫前期重要的病理生理机制[7]。本研究通过检测重度子痫前期孕妇及健康孕妇的外周血凝血功能指标(PT、APTT、FIb及INR)时发现,早发型重度子痫前期组PT比早期对照组明显缩短,其他指标变化的程度较轻。PT代表外源性凝血系统的激活程度,提示早发型重度子痫前期组孕妇的血液呈高凝状态,这可能与外源性凝血系统的激活有关。在本研究中,早发型重度子痫前期孕妇胎盘基底板中VN表达水平升高,在梗塞灶萎陷的绒毛间隙中存在游离的VN染色颗粒,这些从胎盘坏死组织中释放出来的VN可能进人孕妇体循环,起到促进凝血功能的作用,成为使孕妇凝血系统与纤溶系统失衡的重要因素之一。  VN在胎盘组织及孕妇血循环中的促凝机制可能与下列过程有关:(1)在血管壁受损时,血管细胞外基质中的VN与血小板结合,在血管破损处黏附与聚集,从而起到止血的作用。(2)VN能与抗凝血酶Ⅲ及凝血酶结合后形成复合物,一方面这种复合物本身能被细胞表面的VN受体识别而被清除,另一方面,VN通过形成的复合物,暴露肝素结合位点,与肝素结合后抑制其抗凝血功能,从而促进凝血并加速肝素从体内清除。(3)子痫前期孕妇血小板的活化程度更加明显,且与病情的严重程度相关,VN能通过自身的RGD结构与血小板膜糖蛋白结合,促进血小板的黏附,进而促进血小板性血栓形成。(4)胎盘组织缺氧导致纤溶酶原激活抑制物1(PAI-1)水平升高[10],VN是PAI-1的辅助因子,两者相互结合而发挥抑制纤维蛋白溶解及减少细胞外基质降解的作用,从而向凝盹和血栓形成方面转化。这一机制有待于进一步通过检测孕妇血浆中VN水平的变化来证实。  三、VN与子痫前期发病的关系  1967年,首次在人血清中分离出VN,并证实其分布于各种组织的细胞外基质中。过去认为,VN仅由肝细胞合成,然而有研究表明,在很多其他组织,如脑组织、脂肪组织、心脏和骨骼肌组织等均可检测出大量VN mRNA,这提示VN也可以由非肝细胞产生[11-12]。EVT是除细胞滋养细胞、合体滋养细胞之外的第3种滋养细胞,目前认为它曲细胞滋养细胞演变而来,可以转化为合体滋养细胞,是两者之间的过渡形式。本研究发现,胎盘基底板中存在VN mRNA表达,更进一步证实胎盘基底板存在能够转录VN的功能细胞,免疫组化结果证实EVT就是这样的细胞。而在本研究中胎盘梗塞灶边缘,早期梗塞灶中EVT高表达VN,提示胎盘缺氧可能是这种现象的促进因素。这些表达VN的EVT可能是孕妇体内VN的来源之一。此外,胎盘梗塞灶中心坏死细胞成分中存在VN高表达,提示这部分VN可能来源于坏死的滋养细胞中VN的释放,可能是孕妇体内VN的又一来源。总之,本研究结果表明,ⅤN在重度子痫前期尤其是早发型重度子痫前期孕妇胎盘基底板中表达水平明显升高,提示VN与子痫前期发病相关。VN在胎盘梗塞区域及梗塞灶周围中间型滋养细胞中高表达,有利于胎盘局部梗塞成分黏附、聚集、凝血及纤维化,这是一种对母儿有益的保护性机制。同时也提示,可能来自胎盘梗塞灶坏死的滋养细胞释放的EVT所分泌的VN进入孕妇体循环,引起血管内皮细胞损伤,外源性凝血系统激活,凝血与纤溶系统平衡失调,最终导致子痫前期相关临床症状的发生。   参 考 文 献[1] Gilbert JS, Ryan MJ,La Marca BB,et al. 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