MLPA技术用于假性肥大型肌营养 不良症产前基因诊断的价值

假性肥大型肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy，DMD)是最觉的X-连锁隐性致死性遗传疾病之一，群体发病率高达1/3500 男生活婴。女性为致病基因携带者，所生育的男孩中约50%发病，发病人群无明显地址和种族差异。进行性肌萎缩和肌无为伴小腿腓肠肌假性肥大是其典型的临床特征，多累及青少年男性，一般在12岁以前丧失站立和行走的能力，最后因心肌和呼吸肌无力而多于20岁前列于心功能衰竭或呼吸衰竭。本病定位在人类X染色体短臂Xp21上，DMD基因突变是本病的分子遗传学基础，国内外至今对本病无有效的治疗方法，只能对症治疗及支持治疗，故通过产前诊断以杜绝DMD患儿出生仍是目前国人预防DMD的惟一途径。本研究采用多重连接探针扩增(MLPA)技术对DMD基因缺失与重复携带家系的高风险孕妇进行产前基因诊断，取得了满意的临床效果，现将结果报道如下。

资料与方法一、资料来源2005年至2012年对155个携带DMD基因缺失和重复家系的风险胎儿进行了产前诊断,先证者来源于广州医学院第三附属医院、中山大学附属第一医院及广州市儿童医院、南方医科大学南方医院共4家医院,先证者具有典型的DMD临床表现,经血清肌酶、肌电图或肌组织活检等检查,排除了其他神经肌肉系统遗传病。二、方法1.确定DMD基囚携带者:家系先证者先经广州医学院第三附属医院妇产科研究所基囚检测,明确为DMD基因外显子缺失或重复突变;孕妇为DMD基因外显子的杂合缺失或杂合重复突变,即孕妇为DMD基因携带者。DMD基因携带者再次妊娠时,7例孕早期孕妇(孕9~12周)经常规术前检查后,在B超引导下行绒毛膜腔穿刺术,抽取绒毛组织约10mg;148例孕中期孕妇(≥ 孕16周)行羊膜腔穿刺术,抽取10ml羊水样本,待行绒毛和羊水样本的胎儿DMD基因检测。

2.对绒毛标本和血性羊水标本行排除母体DNA污染试验:为了排除绒毛标本和血性羊水标本中可能混人母体DNA而影响产前诊断结果,对取绒毛标本的7例孕妇、出现血性羊水标本的3例孕妇用GoldcneyeT 20A荧光标记试剂盒同时进行样本及孕妇外周血中的DNA短串联重复序列(STR)分型。扩增产物经美国应用生物系统31OO型基因分析仪检测,显示7例绒毛样本的20个基因座均有1个来源于孕妇的等位基因,证明绒毛样本确实来源于胎儿,标本无母体DNA污染,产前诊断结果可靠,并记录该7例孕妇的妊娠转归;而3例血性羊水标本经DNA-田R分型证实混人了母体DNA,进一步经羊水细胞培养去除母源性污染后,再行DMD基因检测。

3,DNA的提取:采用德国QiagCn公司生产的DNA提取试剂盒,DNA提取操作按说明书进行。

4.DMD基因检测:应用荷兰SALSA公司生产的PCl34型和PCl35型试剂盒[24],采用MLPA技术对DMD基因外显子缺失型与重复型患者和DMD基因携带者进行DMD基因的检测,并记录DMD外显子突变发生类型和突变次数分布。DMD基囚检测按以下步骤操作:(1)DNA变性与探针杂交:于98℃加热5min;冷却到25℃加人探针混合物和缓冲液,于95℃温浴2min,然后于60 ℃杂交16h;(2)连接反应:加人连接酶混合液,于54℃ 温浴15min,再于95℃ 加热1min使连接酶失活;(3)PCR反应:加入引物、三磷酸脱氧核苷(dNTP)和聚合酶,行PCR扩增;(4)PCR扩增产物检测:采用美国应用生物系统31OO型基因分析仪进行毛细管电泳并检测PCR产物。

结 果一、DMD基冈产前诊断结果155例孕妇行产前诊断的标本,7例为绒毛组织,其余148例均为羊水。共检出DMD胎儿27例、胎儿DMD基因携带者28例、正常胎儿100例。155例胎儿中,男胎72例,其中27例为患胎,占全部男胎的38%(27/72),45例为正常男胎,占63%(45/72);检出女胎83例,其中28例胎儿为DMD基因携带者,占女胎的34%(28/83);55例为正常女胎,66%(55/83)。对DMD胎儿给予终止妊娠,正常胎儿及DMD基因携带胎儿给予继续妊娠的处理c其后的追踪随访证实,均与DMD基因产前诊断结果相符。

二、DMD基因突变发生类型和累计次数1.DMD基冈突变发生类型:在检出的27例DMD胎儿中,DMD外显子缺失突变22例(14.2%,22/155);外显子重复突变5例,(3.2%,5/155);在检出的28例胎儿DMD基因携带者中,DMD外显子杂合缺失突变25例(16.1%,25/155),外显子杂合重复突变3例(1.9%,3/155)。2.DMD基因外显子累计突变发生次数:DMD基因共有79个外显子,155个家系中基因突变主要分布在外显子45~52之间,其中外显子49突变发生次数最高,共” 次,外显子1和2未发现突变,外显子56~79之间的突变发生次数较低,绝大部分只涉及1次,外显子73涉及过2次。见图1。

三、7例孕妇的绒毛组织DMD基因产前诊断结果及其妊娠转归

7例孕妇的绒毛组织DMD基因诊断结果显示,l例与先证者基因型一样,为DMD基因缺失突变、胎儿DMD基因诊断明确为患儿;1例与孕妇的基因型一样,为DMD基因杂合重复突变,胎儿DMD基因诊断明确为DMD携带者,分别给予终止妊娠和继续妊娠的处理;其余5例胎儿均正常,给予继续妊娠的处理。见表1。

讨 论

DMD是严重的致残、致死性X连锁隐性遗传病,对于本病国内外至今尚缺乏有效的治疗措施,检出DMD携带者并进行产前诊断以杜绝患儿出生,是目前国内外对DMD遗传优生最有效的措施。

本病由DLlclaeme于1868年首先报道,1979年有学者将本病定位在人类X染色体短臂Xp21上,1979年,有人克隆了DMD的编码基因即DMD基因全长cDNA,并且发现DMD基囚突变是DMD发病的分子遗传学基础。

 DMD基因(Xp21)在基因组DNA上跨越乃2500kb,mRNA的长度约14 kb,是当今已知的人类最大的基因,由79个外显子和78个内含子构成,编码产物为抗肌营养不良蛋白(dystrophn)。DMD基因具有突变频率高和突变形式多样的特点。缺失突变、重复突变及单碱基置换是DMD基因主要的突变类型,其中缺失突变最为常见,占55%~65%,重复突变5%~10%。点突变占25%左右。

Southern印迹杂交、DMD基因多重PCR、短串联重复序列PCR及逆转录PCR是国外20世纪90年代以来DMD基因诊断的主要方法。Chamberlain等等[5]设计了9对引物(针对外显子4、8、12、17、19、44、45、48、51)的PCR;Beggs等[6]增设了另外9对引物(针对外显子3、6、13、43、47、50、52、60 、49 ),这18对引物可检出大部分的DMD基因缺失患者。但这种方法不能检测DMD基因缺失型和重复型杂合子携带者。

20世纪90年代以来,国内多个单位引用国外开展的DMD基因诊断方法,主要是用9对引物多重PCR法,不少单位只是淘汰男胎。广州医学院第=附属医院自1994年以来致力于DMD的研究,建立了一套DMD基因诊断和产前诊断技术,包括性别诊断、多重PCR缺失突变分析、STR单体型连锁分析[7]。如果单采用性别分析方法,会错误地淘汰正常男胎的。在本研究中,对72例男胎如只用性别分析方法,绣例正常男胎将被错误地放弃。多重PCR方法只能检测基因突变热点,不能涵盖全部的DMD基因外显子。由于会出现姐妹染色单体互换的机会,STR连锁分析会导致这种交叉互换处的错判,发生误诊的可能。2005年起,广州医学院第三附属医院开展了DMD基因的MLPA检测技术,可快速、可靠地可同时检测DMD基因全部79个外显子的缺失突变与重复突变信息,大大增加了一次实验可检出的遗传信息量,明显地缩短了产前诊断发报告的时间,取样后第2天即可得到检测结果。

MLPA技术可检出杂合缺失和杂合重复等DMD基因携带者,能区分正常和异常的男性、区分女性是正常还是表型正常的DMD基因携带者,并提醒DMD基因携带者到育龄期进行产前检查的必要性。在本研究行DMD基因产前诊断的155例胎儿中,检出男胎72 例,其中27例为DMD患胎;女胎83例,其中28例为DMD基因携带者。对患胎建议终止妊娠,正常胎儿及DMD基因携带者建议继续妊娠。其后进行的追踪随访显示,均与产前诊断结果相符。MLPA技术也有其局限性,与基囚测序技术相比,MLPA技术不能检测出基因的点突变。对于基因点突变的检测,可采用直接进行基因测序的方法找寻突变碱基。该基因跨越2500 kb,如患者都直接进行整个DMD基囚的测序,既耗时而义昂贵,MLPA适用于DMD患者的初筛,是目前最佳的DMD基因缺失型和重复型突变的检测方法。

本研究所检测的155个家系中,DMD基因突变点分布在79个外显子中,而热点集中在外显子侣至52之间。多重PCR方法则不能覆盖所有的外显子,会导致漏诊的发生。临床实践提示我们,胎儿遗传性疾病越能早期诊断,对孕妇的身心影响越小。当诊断为患胎时可选择终止妊娠。本研究中对7例孕妇采用绒毛作为DMD基因检测的标本,在进行DMD基因检测的同时,也进行了孕妇与胎儿的DNA-叩R分型,在明确所检测绒毛样本确实来源于胎儿而非孕妇时,才可以相信DMD基因的检测结果。特别是在胎儿DMD基因型与孕妇基因型相同的情况下,DNA-STR分型显得尤为重要,可避免绒毛膜穿刺取样过程中导致的母源性DNA污染而影响DMD基冈检测结果。

 综上所述,对家系中有DMD先证者的高危孕妇进行产前诊断,可检测出患胎、胎儿DMD基因携带者和正常胎儿,从而避免了患胎的出生和健康男孩被错误地淘汰。本研究所应用的MLPA方法对DMD进行产前基因诊断,在第2个工作日即可得到检测结果,快而准确;同时,本研究提示,通过绒毛活检早期产前诊断DMD,可以减轻孕妇身心痛苦;对DMD高风险胎儿产前诊断获得了满意结果。

参 考 文 献

[l] Emery Ae. Population frequencies of inherited neuromuscular diseases-a world surver. Neuromuseul Disord, 1991,1:19-29.[2] Lalic T,Vossen RH, Coffa J,et al. Deletion and duplication screening in the DMD gene using MLPA. Eur J Hum Genet,2005,13:1231-1234.[3] Li Q,Li SY,Hu DG,etal. Prenatal molecular diagnosic of Duchenne and Becker musecular dystrophy.Beijing Da Xue Xue Bao,2006,38:53-56.[4] Janssen B,Hanmann C,Scholz V,et al. MLPA analysis for the detec1ion of deletions, duplications and complex rearrangements in the dys11ophill gene:potentlal alld piLfdlls Neulogenetics,2005,6:29-35[5] Chamberlain JS,Gibbs RA,Ranier JE,et al. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res,1988,16:11141-11156.

[6]Beggs AH, Koenig M,Boyce FM,et al. Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum Genct,1990,86:45-48

[7]胡冬贵,黄艳仪,黎青,等DMD基囚和SRY纂因单细胞三重及四重套式PCR技术的建立及其日J靠性研究 巾国优生与遗传杂志,1999,7:13-16(收稿日期:2012-10-15)(本文编辑:侯存明)