双酚A对人早孕绒毛组织IGF1、TGFβ1、ADAM12表达的影响

　　作者：丁梅梅1,2，张　毅1，黄元华1，马燕琳1　 作者单位：(1.海南医学院附属医院生殖医学科，海南省生殖医学中心，海南 海口　570102;2.贵阳中医学院，贵州 贵阳　550000)

　　【摘要】 目的：研究双酚A(BPA)水平与人早孕胰岛素样生长因子1(IGF1)，转化生长因子β1(TGFβ1)，以及解整合素样金属蛋白酶12(ADAM12)表达的关系，探讨BPA对绒毛组织可能带来的影响。方法：以40例早期妊娠(6～8)周的新鲜绒毛组织进行体外培养，培养基中加入不同浓度的BPA：A组为1 000×10-6g/L，B组为500×10-6g/L，C组为1×10-6g/L，D组为对照组。收集培养第1天，培养第3天的培养液，采用ELISA方法检测收集的培养上清中TGFβ1、ADAM12及IGF1的分泌水平。结果：绒毛组织培养液第3天的TGFβ1、ADAM12的浓度降低(P<0.05)。第3天培养液中IGF1浓度变化不大(P> 0.05)。结论：BPA对绒毛组织具有细胞毒性作用。

　　【关键词】 双酚A; 胰岛素样生长因子1;转化生长因子β1;解整合素样金属蛋白酶12 ;绒毛组织;酶联免疫吸附测定

　　[ABSTRACT] Objective： To study the effects of bisphenol A (BPA) on the expression of IGF1， TGFβ1， and ADAM12 in chorionic villus early in pregnancy. Methods： Villus samples collected from 40 early pregnancy cases (6～8 weeks) were cultured (in vivo) and treated with BPA at different concentrations. The concentrations of BPA was 1 000×10-6g/L for group A， 500×10-6g/L for group B,1×10-6g/L for group C， respectively， group D was untreated control group. On the 1st， 3rd day， IGF1、TGFβ1、ADAM12 concentrations of supernatant in the culture were measured by ELISA. Results： The concentrations of TGFβ1， ADAM12 were significantly decreased on day 3 (P<0.05)， but IGF1 showed little changes in concentrations(P>0.05). Conclusion： BPA is cytotoxic to villus during early pregancy.

　　[KEY WORDS] Bisphenol A; IGF1， TGFβ1， ADAM12， Chorionic villus; ELISA

　　双酚基丙烷即双酚A(bisphenol A，BPA)是环境雌激素的一种，其又名4一二轻基二苯基丙烷、二苯酚基丙烷，是一类苯酚衍生物。它是制造环氧树脂、聚碳酸脂、聚树脂、抗氧化剂等的前体物质，随着塑料制品的广泛应用，人们接触BPA的机会也越来越多，广泛应用于杀真菌剂、染料及机械仪表、罐头内包装、食品包装材料与饮料容器、餐具、婴儿用瓶的生产，以及作为牙齿密封剂、牙科填充剂的原料之一。BPA可通过消化道、呼吸道、皮肤等途径进入人体。人群中血清、尿样、母体胎盘组织及胎儿血浆等样品中均可检测出不同浓度的BPA。

　　BPA是一种环境内分泌干扰物，具有类雌激素样作用。BPA进入机体后与细胞内雌激素受体结合，通过多种机制产生类雌激素或抗激素作用，从而干扰内分泌系统的正常功能，对机体产生多方面的影响。国内、外研究发现，在胚胎发育早期，低剂量BPA可影响人类的生长发育、性成熟、血液的激素水平、生殖器官的功能、免疫功能、脑细胞某些酶的活性和信号转导等[1-4]。动物实验结果发现，BPA可以引起小鼠绒毛间质水肿、纤维素样坏死、胎盘功能障碍及胚胎的发育异常等[5]。本中心就BPA对人早孕绒毛组织结构的影响的研究发现，BPA可导致绒毛发生病理学改变，同时发现BPA可刺激早期绒毛细胞分泌β-HCG[6]。BPA是否对妊娠带来高风险值得深入的研究。因此，本实验拟通过分析BPA对人早孕绒毛的毒性作用及对胚胎发育的影响，探索BPA对人类妊娠可能存在的危害。

　　1　材料和方法

　　1.1　仪器与试剂

　　二氧化碳培养箱，超净工作台，倒置显微镜，MK3酶标仪(美国Thermo公司)。BPA(天津市大茂化学试剂厂产品),1640培养基(sigma公司生产)，人绒毛膜促性腺激素β-HCG(丽珠医药)，酶联免疫吸附测定试剂盒(上海武昊生物公司生产)。

　　1.2　实验分组及孕妇基本情况

　　取孕6～8周人工流产新鲜绒毛组织40份，分为4组，使BPA的终浓度分别为1 000×10-6g/L(A组)， 500×10-6g/L(B组),1×10-6g/L(C组)，D组为培养液对照组，每组10例。孕妇年龄为22～35岁，无心、肝、肾等严重疾病和生殖道感染性疾病。孕妇各组年龄、妊娠天数比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。新鲜绒毛组织经洗涤剪去蜕膜后，每份取绒毛0.5 g用于实验。 BPA溶于无水乙醇中稀释成不同浓度，随培养液加入各培养瓶。　　表1　各组标本孕妇基本情况比较

　　1.3　体外培养

　　将新鲜绒毛0.5 g置于5 mL的1 640培养液中，于37 ℃、5%二氧化碳、95%湿度的培养箱中培养。培养液中加入不同浓度溶于乙醇的BPA，收集第1天、第3天的培养液，-20 ℃冷冻保存，待ELISA检测TGFβ1、ADAM12、IGF1的浓度。

　　1.4　ELISA检测培养上清TGFβ1、ADAM12及IGF1浓度

　　采用双抗体夹心ELISA法定量检测培养上清中TGFβ1、ADAM12及IGF1的浓度，按照人TGFβ1、ADAM12、IGF1的ELISA试剂盒的操作步骤检测上清液TGFβ1、ADAM12、IGF1的OD值。人TGFβ1检测敏感度为15.8 pg/mL，板内、板间变异系数<7.2%;人ADAM12检测敏感度为24 pg/mL，板内、板间系数<6.5%;人IGF1检测敏感度为0.182 pg/mL，板内、板间变异系数<6.4%。实验重复2次，每次设2复孔。

　　1.5　统计学处理

　　SPSS for windows 12.0 建立数据库，用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　BPA对TGFβ1分泌的影响

　　含BPA的A、B、C组TGFβ1浓度递减，而对照组(D组)呈递增变化;各组第3天与第1天TGFβ1浓度的比较有统计学差异(P<0.05)结果见表2。

　　对各组第3天与第1天TGFβ1浓度之间进行协方差分析，结果显示组间差异有统计学意义(P<0.05)，提示培养液中TGFβ1的浓度与BPA呈负相关，BPA对培养液TGFβ1的浓度呈量效关系，结果见表2。表2　各组标本TGFβ1浓度值比较

　　2.2　BPA对ADAM12分泌的影响

　　含BPA的A、B、C组ADAM12浓度降低，对照组D组的浓度降低;各组第3天与第1天ADAM12浓度的比较有统计学差异(P<0.05)结果见表3。

　　对各组第3天与第1天ADAM12浓度之间进行协方差分析，结果显示组间差异无统计学意义(P>0.05)。表3　各组标本ADAM12浓度值比较

　　2.3　BPA对IGF1分泌的影响

　　含BPA的A组IGF1浓度升高，B组，C组的浓度降低，对照组D组的浓度升高;各组第3天与第1天IGF1浓度的比较无统计学差异(P>0.05)结果见表4。

　　对各组第3天与第1天IGF1浓度之间进行协方差分析，结果显示A组与D组间差异无统计学意义(P>0.05)，B组，C组与D组间差异有统计学意义(P<0.05)。表4　各组标本IGF1浓度值比较

　　3　讨论

　　丁梅梅等.双酚A对人早孕绒毛组织IGF1、TGFβ1、ADAM12表达的影响　 BPA进入机体后与细胞内雌激素受体结合，通过多种机制产生类雌激素或抗雌激素作用，从而干扰内分泌系统的正常功能，对机体产生多方面的影响。TGF-β1具有调节细胞增生与分化，调节细胞与细胞、细胞与细胞外基质的粘连，促进细胞外基质的合成及调节免疫耐受等多项生理功能。研究发现在小鼠及猪胚胎着床窗期，子宫内膜细胞外基质、官腔液及早期发育胚胎中TGF-βI均呈高表达，使胚胎着床部位内膜结构重塑而利于滋养细胞的植入，促进胚胎种植[7-9]。本实验发现，加入不同浓度的BPA的绒毛培养中TGF-β1的浓度有降低，而且BPA浓度与TGF-β1的浓度呈负相关，可证明BPA对胚胎发育的毒性作用。动物实验结果发现，在1 pmol/L～1 nmol/L的双酚A下对体外培养的小鼠胚胎具有一定的毒性作用， 其中对卵黄囊胎盘的结构和功能的影响可能是其发育毒作用的重要基础之一[10]。

　　ADAM12是蛋白水解酶，可以水解类胰岛素样生长因子结合蛋白，通过类胰岛素样生长因子结合蛋白释放胰岛素样生长因子来促进胎儿的生长和发育。本实验测定ADAM12浓度值，发现不同浓度的BPA对绒毛组织中ADAM12的表达均有抑制作用。龙鼎新等[11]发现，BPA干扰胚胎发育过程中脏层卵黄囊(VYS)的结构和功能。60 mg/L以上的BPA在影响培养大鼠胚胎生长发育的同时，对VYS血管分化不良，提示其造血功能降低，使得胚胎生长发育所需的氧和营养物质得不到供应，造成胚胎缺氧和新陈代谢紊乱，从而导致胚胎发育异常。

　　BPA可通过模拟雌二醇(E2)以竞争性方式与雌激素受体(ER)结合，ER活化后进入细胞核，与DNA上雌激素反应元相结合，调节靶基因的转录，使许多蛋白表达，如生长因子相结合，调节靶基因的转录，使许多蛋白表达，如生长因子。Klotz等[12]发现，BPA处理后小鼠子宫胰岛素样生长因子-1(IGF-1)mRNA水平增高，IGF-1受体磷酸化，认为外源性雌激素通过激活子宫IGF-1信号通路发挥拟雌激素样效应。本实验不同浓度的BPA组，IGF-1浓度变化不明显，BPA浓度为1 000×10-6g/L时对IGF-1表达有刺激作用，提示双酚A具有微弱的类雌激素作用。

　　当前双酚A对人类生殖毒性影响的研究较少，而且低剂量的双酚A对慢性生殖毒性研究更有意义。此外单纯的某一机制并不能解释双酚A的毒性，更加全面深入地研究对进一步揭示双酚A的致毒机制更有意义。

　　【参考文献】

　　1　Hunt PA，Koehler KE，et al. Bisphenol A exposure causes meiotic aneuploidy in the female mouse[J]. Curr Biol,2003,13(7)：546-553.

　　2　崔金山， 张玉敏， 段志文， 等. 双酚A与壬基酚混合染毒对小鼠生精功能的影响 [J] .工业卫生与职业病，2004,30 (5)：289-292.

　　3　Tan BL，Kassim NM. Assessment of pubertal development in juvenile male rats after sub-acute exposure to bisphenol A and nonylphenol [J] . Toxicol Lett， 2003,143 (3)：261-270.

　　4　王亚民， 徐晓虹， 张婧围， 等.围产期母鼠染毒双酚A 对雄性子代脑内谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸受体发育的影响 [J] .生物物理学报，2009,25(2)：99-105.

　　5　RichterI CA，Birnbaum LS. In vivo effects of bisphenol A in laboratory rodent studies [J] . Reprod Toxicol,2007,24 (2)：199-224.

　　6　林强，张毅，吴丹梅，等.双酚A对人早孕绒毛组织结构及β-HCG分泌的影响[J].环境与职业医学，2010,27(4)：216-218.

　　7　Chow JF，Lee KF，Chan ST，et a1. Quantification oftransfotruing growth faetor betal(TGFbetal)mRNA expression in mouse preimplantation embryos and determination of TGF beta receptor(type I and typeⅡ)expression in mouse embryos and reproductivetract[J].Mol Hum Reprod,2001,7(11)：1047-1056.

　　8　Tamada H，Mcmaster MT，Flanders KC，et a1.Cell type-specific expression of transforming growth factor-betal in the mouse uterus during the periimplantation period[J].Mol Endocrinol,1990,4(7)：965-972.

　　9　Gupta A，Dekaney CM，Bazer FW，et a1.Beta transforming growth factors(TGFβ)at the porcine conceptus-maternal interface.Part II：uterine TGFβ bioactivity and expression of immunor eactive TGFβs(TGFβ1，TGFβ2，and TGFβ3)and their receptors(type I and type II)[J].Biol Reprod,1998,59(4)：911-917.

　　10　Welshons WV， Nagel SC， Vom saallarge FS. Large effects from small exposures. III. endocrine mechanisms mediating effects of bisphenol A at levels of human exposure[J]. Endocrinol,2006,147 (6)：56-69.

　　11　龙鼎新，陈星，高丽芳，等.双酚A 对小鼠早期胚胎发育毒性的体外实验研究 [J].中国生育健康杂志，2003,11(1)：34-37.

　　12　Klotz DM ， Hewitt SC，Korach KS，et al. Activation of a uterine insulin-like growth factor I signaling pathway by clinical and environmental estrogens：requirement of estrogen receptor-alpha[J]， Endocrinol ,2000,141(9)：3430-3439.