Ｆ１０基因对细胞中ＰＣＮＡ和Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１表达的影响

　　作者：曹晓敏,庞战军,全,松,邢福祺　　作者单位：1. 中山大学附属第二医院妇产科， 广东 广州 510120; 2. 中山市人民医院博士后工作站， 广东 中山 528403;3. 南方医科大学南方医院妇产科， 广东 广州 510515

　　【摘要】【目的】 确定F10基因表达对细胞生长的影响，明确F10基因的功能。

　　【方法】 构建F10基因的真核表达载体，转染重组pRc-CMV2-F10质粒于肺癌细胞系A549， 筛选并获得稳定表达F10基因的细胞克隆A549-F10。通过MTT实验和流式细胞检测F10对细胞生长的影响;通过免疫组化检测细胞中增殖核抗原(PCNA)和细胞周期素D1(cyclin D1)的表达。【结果】 转基因的G418抗性克隆能够检测到F10表达。MTT和流式结果显示F10有促进细胞增殖的作用。阳性克隆的细胞株中PCNA和cyclin D1相对较高水平的表达。【结论】 F10基因通过上调PCNA和cyclin D1的表达，促进细胞的生长增殖。

　　【关键词】 F10基因; 增殖细胞核抗原; 细胞周期素D1

　　Effect of F10 Gene on Expression of Proliferating Cell Nuclear Antigen and Cyclin D1

　　CAO Xiao-min1，2， PANG Zhan-jun3， QUAN Song3， XING Fu-qi3?鄢

　　(1. Department of Obstetrics and Gynecology， The Second Affiliated Hospital， SUN Yat-sen University， Guangzhou 510120， China; 2. Post-doctoral Workstation， Zhongshan People?蒺s Hospital， Zhongshan 528403， China;

　　3. Department of Obstetrics and Gynecology， Nanfang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China)

　　Abstract： 【Objective】 To study the effect of F10 on the activities of cell growth and to identify the function of F10. 【Methods】 Eukaryotic expression vectors of F10 gene were constructed and pRc-CMV2-F10 plasmid was transfected and recombined into the lung cancer cell line A549 by Lipofectamine 2000. The cell clone A549-F10 which stably expressed F10 gene was obtained by detecting the mRNA expressing of F10 in G418-resistant clones. Effects of F10 gene on the activities of cell growth were detected by MTT and flow cytometry. The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and cyclin D1 were detected by immunohistochemistry. 【Results】 Expression of F10 gene were detected by G418-resistant transgenic clones. The results of MTT and flow cytometry showed that F10 gene could promote cell proliferation. The expression of cyclin D1 and PCNA in A549/F10 transplants were relatively high. 【Conclusion】 F10 gene promotes the cell proliferation by up-regulating the expression of PCNA and cyclin D1.

　　Key words： F10 gene; proliferating cell nuclear antigen; cyclin D1

　　F10基因是新克隆的在葡萄胎中表达上调的基因[1]，差异显示PCR粗筛选显示F10基因可能参与细胞的增殖和凋亡过程。研究表明F10基因在葡萄胎组织、侵蚀性葡萄胎、绒癌中均阳性表达且依次增强。初步预测F10可能与葡萄胎的恶性变及肿瘤的侵袭行为有关[2];原位杂交结果表明F10 在卵巢腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等腺癌中均阳性表达。提示F10与上述肿瘤的发生有关[3]。另外F10通过上调AP1、下调NF-KB的表达参与转录因子活性调节过程。为明确F10基因的功能，通过建立稳定表达F10基因的肺癌细胞系A549的细胞克隆，通过MTT、流式细胞术、PCNA、cyclin D1的表达来检测其在细胞增殖和细胞周期进展中的作用，进一步明确F10的功能。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　A549细胞株由广州医学院医学实验中心提供， TRIzol， ThermoScript RT-PCR System及细胞培养试剂购于美国Invitrogen公司，荧光定量PCR kit购自Stratagene公司，Electroporation buffer 购自Eppendorf公司，质粒提取试剂盒购自Qiagen公司，限制性内切酶购自NEB公司，G418购自Calbiochem公司。96孔板及流式细胞仪(Aria)为BD公司的产品，ELx酶标仪为美国BIO-TEK公司的产品，单克隆小鼠抗人细胞周期蛋白(cyclin D1)、单克隆大鼠抗人细胞核心抗原(PCNA)为DAKO公司的产品。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞转染及稳定克隆的建立和鉴定 前期实验证实F10基因在A549细胞中低表达，F10基因转染A549细胞前后其基因表达水平有差异，故对F10的转基因研究时肺癌细胞A549是一个很好的细胞模型，可以真实的反应F10基因的功能。转染参考Electroporation protocol，当细胞在指数生长期90%的融合度时，将重组质粒pRc-CMV2/F10转染到肺癌细胞株A549中，同时转染pRc/CMV2作为阴性对照，G418(浓度600 μg/mL)筛选3周后出现抗性克隆，选一定数目单一克隆扩增培养，提取总RNA，设计扩增F10的引物(同1.2.3)，根据荧光定量SYBRR GREEN-PCR试剂盒操作说明进行，筛选出能够稳定、高效表达F10基因的单细胞克隆。

　　1.2.2 噻唑蓝(MTT)比色法分析 A549细胞、稳定表达F10基因及稳定表达空载体的A549细胞系共2组细胞接种于96孔板，每孔细胞数5 × 103个。细胞共培养在100 μL含150 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中，37 ℃，体积分数5%CO2的条件下培养。24 h后开始检测，检测前每孔加10 μL，5 mg/mL的MTT试剂，继续培养4 h，然后弃除培养基，再加入100 μL DMSO 37 ℃避光孵育10 min后，酶标仪测定570 nm波长的吸光度值，设3个平等孔，每24 h检测1次，连续测定6 d， 绘制各组细胞的生长曲线。

　　1.2.3 流式细胞仪分析细胞周期 pRc/CMV2/F10质粒及pRc/CMV2瞬时转染接种于6孔板中的A549细胞，每孔细胞2.5 × 106个，设3个平等孔。细胞共培养在2 mL含150 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基中，37 ℃，体积分数5%CO2的条件下培养。24 h、48 h、72 h开始收集细胞悬液1 200 r/min (r = 16 cm) 离心5 min，弃上清，PBS洗涤细胞3次，每次1 000 r/min (r = 16 cm) 5 min，-20 ℃ 700 mL/L乙醇2 mL 1 200 r/min(r = 16 cm)离心5 min，弃上清。PBS冼2次，加入50 μL RNAse(终浓度50 μg/mL PI 染色，混均，4 ℃避光放置30 min，计数10 000个细胞，用Modifit LT软件(美国BD公司)分析细胞DNA含量和凋亡率。

　　1.2.4 PCNA和cyclin D1免疫组化检测 按试剂盒说明书进行，pRc/CMV2/F10基因及pRc/CMV2瞬时转染接种于6孔板中的A549细胞，每孔细胞2.5 × 106个，设3个平等孔。转染24 h后，6孔板中的细胞PBS洗2次，加入40 g/L的多聚甲醛固定30 min， PBS洗2次，每次3 min，3 g/L Triton 固定10 min 30 g/L H2O2清洗2次，PBS冲洗，加一抗(即用型PCNA抗体直接滴加，cyclinD1抗体按1：30稀释)，4 ℃孵育过夜。PBS冲洗3次，加入二抗孵育2 h，PBS冲洗3次，每次3 min，DAB显色。

　　1.2.5 统计学方法 荧光定量PCR用Ct 比较法来测算转录水平差异。Xn = X0 × (1 + Ex)n，Ex = ER，Fold = 2ˉ△Ct，ΔΔCt = (Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)，其中：Ct1：处理样品待测基因的临界循环数，Ct2：处理样品持家基因的临界循环数。多组间均数比较采用单因素方差分析Q检验，线性资料采用析因分析的统计方法。

　　2 结 果

　　2.1 质粒pRC/CMV2-F10和pRC/CMV2鉴定结果

　　酶切和测序结果表明重组载体pRC/CMV2-F10为正向连接。

　　2.2 抗性克隆的鉴定

　　G418持续筛选，未转染的细胞1周内全部死亡，pRc-CMV2/F10和pRc-CMV2转染A549细胞系，2周时转染细胞大部分死亡。持续加压3周可见散在G418抗性克隆出现。荧光定量PCR鉴定抗性克隆，结果根据荧光定量公式进行计算：同一个克隆△Ct = ct-ctactin，不同细胞克隆之间△△Ct = △Ct研究组-对照组，研究组mRNA相对含量 = 2-△△Ct X对pRc-CMV2转染A549细胞系组mRNA的含量。筛选出二株高表达的细胞克隆。

　　2.3 F10对A549细胞生长的影响

　　根据酶标仪连续6 d测定的570 nm波长吸光值绘制出肺癌细胞A549的生长曲线，结果显示，第2天开始，F10基因表现为对A549细胞生长促进作用，并随培养时间延长及培养细胞数量的增加，促进作用愈明显，第4天促进率达到43.5%。

　　2.4 流式细胞仪分析细胞周期的结果

　　pRc/CMV2/F10基因转染细胞48小时较对照组细胞中G2/M期细胞比例升高2.2倍，S期升高1.2倍。二组相比差异有显著性意义(P = 0.0002)。

　　2.5 F10基因对PCNA和cyclin D1表达的影响

　　免疫组化显示，PCNA在A549/F10中强阳性表达，在A549/空载体中呈中度阳性表达。各组中cyclin D1表达水平的变化和PCNA的改变一致。表明F10基因的表达使A549细胞中PCNA和cyclin D1表达上调。

　　3 讨 论

　　F10基因为新克隆的葡萄胎中表达上调的基因，前期实验结果提示F10基因与滋养细胞的侵袭性相关，还可能参于某些腺癌的发生并观察了F10基因编码蛋白在细胞内的定位情况[4-5]。采用差异显示技术高通量的筛选转染F10基因后宿主细胞基因表达的变化，得出F10基因可能参与促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的过程[6-7]。从而推出新基因F10可能是一个新的癌基因。

　　恶性肿瘤的发生与细胞异常增殖密切相关，PCNA是一种调节蛋白，在细胞周期G1期开始升高，S期合成达最高峰，G2期和M期则又下降，并认为它在DNA合成和细胞增殖调控中起重要作用。PCNA mRNA一般仅积聚在增殖细胞中，而在静止细胞中则缺乏，因此，PCNA可很好地反映细胞动力学的变化，代表细胞增殖的潜能[8-10]。本研究中A549/F10细胞较A549/空载体中PCNA的表达高，表明F10基因促进了A549细胞的增殖。

　　细胞的增殖失控是肿瘤组织最显著的特点，癌基因、抑癌基因对细胞增殖周期各环节直接或间接的调控作用发生异常时，可导致肿瘤的发生[11]。CDK是细胞周期调节的中心，其成员的激活和磷酸化，可促进细胞由G1期向S期及G2期向M期的转变，CDK4需与细胞周期素D1蛋白结合才能被激活，任何引起细胞周期素D1蛋白过度表达，都会导致细胞分裂增殖失控[12]。本研究发现，表达F10基因的A549细胞中cyclin D1表达水平较对照组增高。表明F10促进了cyclin D1的表达，缩短G1期时间及加速G1的进展。因而加快了细胞周期的进展。

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