Cdk4在宫颈癌和宫颈上皮内瘤组织 中的表达

　　作者：郑小娟,庞天云,邓飞,邹琳,李飞虹　　作者单位：1.广东医学院病理学教研室，广东湛江 524023;2.广东医学院附属医院妇产科，广东湛江

　　【摘要】 目的 观察Cdk4在宫颈肿瘤发生发展中的表达情况。方法 用免疫组织化学染色的方法对141例宫颈组织(19例慢性宫颈炎、15例低度宫颈上皮内瘤变、41例高度宫颈上皮内瘤变和66例宫颈浸润癌)进行检测，确定染色强度，计算阳性率并进行χ2检验分析。结果 按照上述病变顺序，Cdk4染色强度由弱变强，阳性率由低到高，阳性率分别是21.1%、46.7%、73.2%、92.4%，经χ2检验，P<0.01。结论 Cdk4在宫颈肿瘤中的表达升高，与宫颈肿瘤的发生发展关系密切。

　　【关键词】 宫颈癌; 宫颈上皮内瘤; Cdk4

　　Expression of Cdk4 in cervical carcinoma and cervical intraepithelial neoplasia ZHENG Xiaojuan1,PANG Tianyun2,DENG Fei1,ZOU Lin2,LI Feihong1,HU Xinrong1　(1. Department of Pathology, Guangdong Medical College, Zhanjiang 524023, China)

　　Abstract：Objective To investigate the expression of Cdk4 in the occurrence and development of cervical neoplasma. Methods Cdk4 expression was determined by immunohistochemical staining in 141 cervical specimens (chronic cervicitis, 19; low degree of intraepithelial neoplasia, 15; high degree of intraepithelial neoplasia, 41; invasive cervical cancer, 66), and its positive rate and staining intensity were analyzed. Results Cdk4 expression rates in chronic cervicitis, low and high degree of intraepithelial neoplasia, and invasive cervical cancer were 21.1%, 46.7%, 73.2% and 92.4%, respectively. The positive rate and staining intensity of Cdk4 in cervical cancer were significantly higher than those in other lesions (P<0.01). Conclusion The expression of Cdk4 is upregulated in cervical cancer, which might be related to the occurrence and development of cervical tumor.

　　Key words: cervical carcinoma; cervical intraepithelial neoplasia; Cdk4

　　Cdk4是一种细胞周期素依赖激酶。它与Cyclin D1结合使PRb磷酸化，促进细胞周期从G1期进入S期，而与P16结合后，导致PRb去磷酸化，抑制细胞周期进行[1]。在正常细胞周期中，Cdk4的含量保持稳定，其对细胞周期的影响取决于其与Cyclin D1或P16的结合状态。在多种类型肿瘤的发生和发展中，Cdk4的含量不稳定，表现为表达升高[24]。虽有文献报道宫颈癌的Cdk4表达升高[56]，但这方面的文献还不多见。本文对宫颈癌、高度和低度宫颈上皮内瘤变和宫颈炎上皮组织的Cdk4表达水平进行了观察。现将结果报道如下。

　　1 材料和方法

　　1.1 标本

　　从广东医学院附属医院病理科收集2004年1月至12月石蜡包埋标本141例，其中慢性宫颈炎19例、低度宫颈上皮内肿瘤(LCIN)15例、高度宫颈上皮内肿瘤(HCIN)41例、宫颈鳞状细胞癌66例。

　　1.2 免疫组化染色步骤

　　根据文献[78]的方法稍作修改。石蜡切片4μm厚，贴于用多聚赖氨酸处理的载玻片，在60℃中烤60min;切片常规脱蜡水化;用0.01　mol/L柠檬酸缓冲液在高温高压下进行抗原修复;PBS冲洗后滴加3%甲醇过氧化氢室温孵育15 min，阻断过氧化物酶;预冷PBS洗后，滴加正常山羊血清室温孵育20 min，甩去多余血清，不用冲洗;滴加1∶100稀释的小鼠抗人Cdk4抗体(ZM0089，北京中杉公司)，4℃冰箱孵育过夜; 预冷PBS洗3次，每次5 min，滴加生物素标记的二抗，室温孵育15 min;预冷PBS洗3次，每次5 min，滴加链霉素亲生物素蛋白过氧化物酶溶液，室温孵育15 min;预冷PBS洗PBS洗3次，每次5 min，滴加DAB显色剂在室温下避光显色3～10 min(在显微镜下控制显色时间)，蒸馏水洗涤;苏木素轻度复染，自来水返蓝15 min，晾干，中性树胶封片。生物素标记的二抗、链霉素亲生物素蛋白过氧化物酶溶液、DAB显色剂为SP9000通用试剂盒(北京中杉公司)。以PBS代替一抗作空白阴性对照，以已知Cdk4阳性的宫颈癌组织作阳性对照。

　　1.3 结果判断

　　根据文献[78]标准稍作修改。空白阴性对照的细胞不显色，阳性对照的细胞胞浆和胞核呈黄色、棕黄色或棕褐色。淡黄色为弱阳性，棕黄色为中阳性，棕褐色为强阳性。阴/阳性病例判断：由两人分别独立对实验结果进行双盲法评估。每一切片随机选择5个视野(×100)，在显微镜(×400)下计数每个视野100个肿瘤细胞中阳性细胞的比例，取5个视野的平均百分数为判定结果。阳性细胞百分比<5%为阴性表达病例，>5%为阳性表达病例。

　　1.4 统计学处理

　　采用χ2检验及χ2分割法，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　阴性对照的细胞不着色，阳性对照细胞的核和浆着棕黄或棕褐色。大部分宫颈慢性炎的宫颈上皮不着色，少数病例的基底细胞染成黄色。异型增生的细胞在胞浆和胞核中着棕黄或棕褐色。阳性着色细胞几乎占据LCIN、HCIN、浸润癌的整个病变区域。就染色强度看，浸润癌和HCIN着色强，LCIN和基底细胞着色较弱。所示，CDK4阳性表达率以宫颈浸润癌为最高(92.4%)，其次是HCIN(73.20%)，再次是LCIN(46.7%)，而宫颈炎鳞状上皮的CDK4表达率为21.1%。除HCIN组与浸润癌组的CDK4阳性表达率差异无统计学意义外，其余各组的CDK4表达率均与浸润癌组的CDK4表达率的差异有统计学意义。CDK4在宫颈肿瘤病变中的表达loma virus，HPV)感染引起。正常宫颈上皮被HPV感染后，首先形成LCIN，后变为HCIN，最后进展到浸润癌[1]。本文结果显示在由轻到重的宫颈系列瘤变中，Cdk4的表达率逐步由低到高，染色强度由弱到强，其中以浸润癌的Cdk4表达率最高，达92.4%，说明Cdk4可能参与宫颈肿瘤的发生发展。

　　Cdk4在食管癌、胃癌、膀胱癌等肿瘤中的表达升高，阳性率约为46.7%至54.8%[24];Cdk4在宫颈癌中的表达阳性率通常更高，达93.0%，且随着瘤变程度升高而升高[9]。本文结果与文献报道的Cdk4在宫颈浸润癌中的阳性表达结果相一致。Cdk4在宫颈癌中的表达普遍比在其他类型肿瘤中高的意义还不清楚，或许是Cdk4的表达与宫颈癌的发生发展的关系比较密切的缘故。

　　Cdk4的功能与P16和CyclinD1有关。P16和CyclinD1竞争性地与Cdk4结合，产生两种不同的效应。P16与Cdk4结合后使PRb去磷酸化产生抑制细胞生长和抑制肿瘤发生发展的作用，而CyclinD1与Cdk4结合后使PRb磷酸化产生促进细胞生长和促进肿瘤发生发展的作用[1]。在多种肿瘤中，Cdk4和CyclinD1表达升高，P16表达下降，显示出这些细胞周期调节因子的改变有利于肿瘤的发生发展[24]。在宫颈肿瘤中，Cdk4和P16的表达成比例显著升高，而CyclinD1表达升高不太确切[1,5,6,9]。虽然显示出Cdk4和P16的表达改变与宫颈癌的发生发展的关系非常密切，但难以解释其作用机制。目前的观点认为高危型HPV感染宫颈上皮细胞后，其病毒癌基因E7蛋白结合并降解PRb，中断了P16/Cdk4 的抑癌信息，使P16/Cdk4不能抑癌，同时又通过PRb的负反馈调节机制使P16的表达升高[1]。由此看来，P16 和Cdk4在宫颈癌中表达升高既不能抑癌，也不促癌，而仅是高危型HPV感染和PRb被降解的指示器。至于Cdk4在宫颈癌中表达升高的原因未完全明了，目前没有明显的证据与HPV感染有关，但可能与Cdk4基因的扩增有一定的关系[10]。

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