siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响

　　作者：李大可,彭芝兰,周斌兵,作　　作者单位：1.南京医科大学第一附属医院 妇产科,江苏 南京 210029; 2.四川大学华西第二医院 妇科，四川 成都

　　【摘要】 目的: 观察HPV16 E6 siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响。方法： 利用脂质体将HPV16 E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞，通过荧光定量RTPCR检测E6 mRNA的变化，流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化，MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化。结果： HPV16 E6 siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6 mRNA和E6蛋白的表达，抑制率分别为89.5%和98.1%;表达载体可明显增加细胞凋亡率，抑制细胞的增殖和克隆的形成。结论： HPV16 E6 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，增加细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成。

　　【关键词】 siRNA表达载体; 宫颈癌; 细胞增殖; 凋亡

　　研究表明，人乳头瘤病毒(HPV) 16型E6 基因在宫颈癌的发生发展及恶性表型的维持中起着至关重要的作用，因此它已成为宫颈癌基因治疗的理想靶点之一。RNA干扰(RNAi)技术是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法[12] 。已有研究证实，化学合成的小干扰RNA (siRNA) 能有效地抑制目的基因的表达，但作用持续时间短，而siRNA表达载体的方法可能延长作用持续时间[3]。本研究拟通过载体介导的RNAi技术来封闭宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，观察HPV16 E6 siRNA表达载体对Caski细胞增殖的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 细胞转染

　　Caski细胞为HPV16阳性的宫颈癌细胞株，购自武汉大学典型物培养保藏中心。在研究中用脂质体法将HPV16 E6特异性siRNA表达载体E62(由第一作者所在实验室设计构建保存)[4]和空载体P0转染Caski细胞，通过G418(1 500 μg•ml-1)抗性筛选，至空白对照细胞完全死亡后，降低G418为750 μg•ml-1，转染后14 d得到抗性克隆细胞，分别命名为Caski E62、Caski P0。收集抗性克隆形成后1周的细胞。

　　1.2 荧光定量RTPCR检测HPV16 E6 mRNA的表达1.2.1 细胞总RNA的提取及逆转录 操作参照试剂盒[TrizolTMRNA Isolation Reagent(GIBCO)和RevertA idTM First Strand cDNA synthesis Kit(MBI)]说明书进行。

　　1.2.2 荧光定量RTPCR扩增 实验设Caski组(空白对照组)、Caski P0组(空质粒转染组)、Caski E62组3组，每项检测重复3次，取平均值。为避免收集细胞和实验过程中RNA的降解、所收集细胞数量的差异以及实验过程中操作带来的误差，计算时用细胞中表达恒定的看家基因GAPDH(3磷酸甘油醛脱氢酶)逆转录扩增产物量的CT值来校正HPV16 E6 mRNA表达变化。HPV16 E6上游引物为5′GAATGTGTGTACT

　　GCAAGCA3′，下游引物为5′CACAGTGGCTTTTGACA

　　GTT3′，TAQman探针为5′CAGCATATGGATTCCCATC

　　TC3′。GAPDH上游引物为5′TGGGTGTGAACCACG

　　AGAA3′，下游引物为5′ GGCATGGACTGTGGTCAT

　　GA3′，探针为5′CTGCACCACCAACTGCTTAGC3′。其中探针于5′端标记荧光发光基团FAM，3′端标记荧光淬灭基团TAMRA(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。在荧光定量PCR仪上进行PCR，扩增条件如下: 94 ℃ 1 min;94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45个循环;55 ℃ 30 s。从PCR动力学曲线读取荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数CT值。

　　1.2.3 荧光定量RTPCR结果计算 参照文献[5]报道的比较阈值法。从各样品荧光定量PCR动力学曲线中判读其Ct值，用处理组样本基因的Ct值减去处理组参照基因的Ct值，得到ΔCt1，同样，用对照组样本基因的Ct值减去对照组参照基因的Ct值，得到ΔCt2，再用ΔCt1减去ΔCt2，得到ΔΔCt，即ΔΔCt=ΔCt1-ΔCt2。处理组样本基因相对于对照组样本基因的量通过公式：处理组样本基因/对照组样本基因=EX-ΔΔCt 。抑制率=(1-EX-ΔΔCt)×100%。

　　1.3 流式细胞仪检测HPV16 E6蛋白的表达

　　流式细胞仪由四川大学人类疾病生物治疗实验室提供。流式细胞术检测阴性对照组、Caski组、Caski P0组、Caski E62组4组细胞中HPV16 E6蛋白的表达，每项检测重复3次，取平均值。蛋白抑制率公式：[1-(转染后待测样品的蛋白荧光强度-阴性对照)/(未转染样品的蛋白荧光强度-阴性对照)]×100%。

　　1.4 细胞凋亡测定

　　胰酶消化培养好的细胞，得到细胞沉淀，置于1 ml eppendorf管中，PBS缓冲液重悬细胞，1 000 r•min-1离心5 min得到细胞沉淀。再次重复洗涤沉淀过程，加入75%乙醇重悬细胞并固定30 min以上，送流式细胞仪进行细胞凋亡率的检测。

　　1.5 生长曲线的测定

　　分别取对数生长期的Caski、Caski P0、Caski E62细胞,消化后用含10%小牛血清的RPMI 1640 培养液制成单细胞悬液,调整浓度为105ml-1，以50 μl•孔-1接种于96孔培养板，每组设3个复孔，同时设不加细胞只加培养液的空白对照孔，放入37 ℃、5% CO2 孵箱培养;于培养1、2、3、4、5 d 后，每孔加入MTT溶液(5 mg•ml-1) 20 μl，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO振荡，并于酶联免疫检测仪490 nm 波长下测定各孔光吸收(A)值。以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。

　　1.6 细胞克隆形成率的测定

　　取对数生长期细胞胰酶消化成单细胞悬液，以每孔200个细胞分别接种于6孔板中，每孔设4个复孔，于37 ℃、5%CO2饱和湿度环境下静止培养2周。终止培养，弃去培养液，PBS(0.01 mmol，pH 7.4)洗涤2次，纯甲醇固定15 min，姬姆萨染色20 min，流水洗去染色液，空气干燥。显微镜下计数克隆数。将细胞数大于50个细胞团作为克隆计数，取平均克隆数计算克隆形成率。克隆形成率(%)=平均克隆数/每孔加入的单细胞数×100%。

　　1.7 统计学处理

　　实验结果以x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，多组的两两比较用SNK法。

　　2 结 果

　　2.1 HPV16 E6 mRNA表达的变化

　　根据标准曲线计算扩增效率EX=1.8，即CT值减少1个循环对应模板DNA增加1.8倍。可见，Caski E62组细胞E6 mRNA表达较Caski组明显降低(P<0.05)，抑制率为92.15%。而Caski P0组细胞与Caski组相比，E6 mRNA的表达差异无统计学意义, HPV16 E6和内对照GAPDH mRNA的 Ct值、ΔΔCt值及抑制率与Caski组比较，1)P<0.05,2)P>0.052.2 HPV16 E6 蛋白表达的变化

　  可见，Caski细胞E6蛋白表达较Caski组降低(P<0.05)，抑制率为98.1%。而Caski P0细胞与Caski组相比，E6蛋白的表达差异无统计学意义。

　　2.3 转染RNA干扰表达载体后Caski细胞凋亡情况的变化 转染 Caski E62、 Caski P0质粒的阳性克隆株及Caski细胞的凋亡峰。

　　Caski E62、Caski P0及Caski组细胞的凋亡率依次为27.1%、1.4%及1.3%，可见转染RNAi表达质粒HPV16 E6蛋白荧光表达强度值及抑制率 的细胞凋亡率明显高于Caski P0及Caski组。

　　2.4 MTT 法检测细胞生长曲线的变化

　　转染质粒E62、空质粒P0的Caski细胞阳性克隆及Caski细胞第1～5天的MTT A值及细胞生长曲线见表3和图2。表3 各组细胞不同时间点的A值 可见转染RNA干扰表达载体E62的细胞生长速度较Caski组细胞明显减慢。而Caski P0组与转染前相比，细胞增殖无明显变化。Caski P0 和Caski 细胞的生长速率相近，而Caski E62细胞生长速度明显减慢,表明E6 siRNA 表达载体E62的导入影响了Caski细胞的生长。

　　2.5 细胞克隆形成率

　　统计学分析显示，Caski E62组的克隆形成数与Caski组及Caski P0组比较差异有显著性(P<0.05)，Caski P0细胞的克隆形成数与Caski细胞比较差异无显著性(P>0.05)。见表4。表4 各组细胞的克隆计数及克隆形成率 与Caski组比较，1)P<0.05,2)P>0.05

　　3 讨 论

　　siRNA目前主要是通过体外直接化学合成，但化学合成的siRNA引起的基因沉默效应存在着作用时间短(一般不超过1周)而且耗费大等缺点。本研究使用的pSilencer 3.0H1载体含H1启动子，可在绝大多数哺乳动物细胞内自主合成小分子RNA，被广泛应用于反义RNA技术。载体包含有RNA聚合酶Ⅲ(PolⅢ)启动子(Hl prom)和1个有5个T的转录终止位点，1个保守的A开始转录合成RNA。遇到5个连续的U即终止，转录产物在转录终止位点的第2个碱基处终止，非常精确。只要将编码一小段对应目的基因特异序列的、其RNA能形成发夹结构的RNA序列插入载体中Pol Ⅲ启动子的下游，转入哺乳动物细胞，载体就能表达出短发夹状RNA(small hairpin RNA，shRNA)，这种RNA很快在细胞中加工成为大约21个碱基大小的双链RNA分子，随后启始RNA干扰过程[6] 。该质粒带有可表达抗氨基糖苷类抗生素G418蛋白——氨基糖磷酸转移酶的Neo基因，通过G418筛选,得到能长时间稳定表达发夹状RNA的阳性克隆细胞。

　　本研究利用前期构建成功的HPV16 E6特异性siRNA表达载体来转染Caski细胞，观察它对E6基因的抑制作用。结果发现：在抗性克隆形成后1周，即转染后3周，E6 siRNA表达载体能使Caski 细胞E6 mRNA和蛋白的表达被明显抑制，抑制率分别为89.5%和98.1%，而空载体对二者的表达皆无明显影响，说明HPV16 E6 siRNA表达载体能特异高效地抑制Caski细胞E6基因的表达;而且siRNA表达载体的作用持续时间明显超过了化学合成siRNA的作用时间，说明HPV16 E6 siRNA表达载体能较长期地抑制Caski细胞E6基因的表达。

　　转染E62、P0质粒的阳性克隆及Caski组细胞的凋亡率分别为27.1%、1.4%、1.3%，可见我们构建的HPV16 E6 RNAi表达载体转染细胞后明显增加了细胞的凋亡率，而空质粒P0组的凋亡率并未增加，排除了质粒本身及G418筛选可能造成的影响，说明质粒是通过抑制E6基因的表达促进细胞凋亡的。

　　E6蛋白致癌的关键是由于它与p53结合,导致p53降解,从而使p53对细胞增殖周期相关因子 p21(WAF1)、增殖细胞核抗原(PCNA)等的调节作用丧失，细胞中DNA损伤累积造成细胞癌变。抑制E6的表达可使肿瘤细胞的p53反应蛋白表达上调，激活caspase9和caspase3，抑制细胞的增殖[78]。细胞生长曲线显示，E62表达载体明显抑制了肿瘤细胞的生长，Caski E62细胞在软琼脂上形成克隆能力也明显低于Caski P0和Caski细胞，提示我们构建的RNA干扰表达载体明显抑制了肿瘤细胞的增生和克隆的形成。而空质粒载体转染的Caski P0组细胞生长速率和克隆形成率与Caski组细胞比较无明显变化，排除了质粒本身及G418对细胞的影响。

　　综上所述，HPV16 E6 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，有效抑制肿瘤细胞的增殖，这为HPV相关宫颈癌的基因治疗提供了理论依据。

　　【参考文献】

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