IGF-Ⅱ和HGF的表达与卵巢癌微血管密度的关系

　　作者：郑艳莉，刘曼华，鲁晓燕，陶 潜，杨其昌，朱 燕 作者单位：(南通大学第二附属医院1妇产科，2病理科，南通 226001)

　　【摘要】 目的:探讨胰岛素样生长因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)和肝细胞生长因子(HGF)在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与肿瘤微血管密度、肿瘤侵袭、脉管侵犯及转移的关系。方法:应用免疫组化S-P法检测IGF-Ⅱ和HGF在上皮性卵巢癌及良性卵巢上皮性肿瘤中的表达。用CD34标记卵巢癌组织中的微血管，采用图像分析进行微血管密度(MVD)测定。结果: IGF-Ⅱ和HGF在卵巢癌中的表达阳性率分别为76.2%(48/63)和90.5%(57/63)。两者在良性上皮性卵巢肿瘤中均为弱阳性表达，良性上皮性卵巢肿瘤中IGF-Ⅱ为23.3%(7/30)，HGF为26.7%(8/30)。IGF-Ⅱ和HGF在卵巢癌与卵巢良性上皮性肿瘤的表达有差异(P<0.05)。IGF-Ⅱ和HGF表达阳性的患者MVD水平分别高于表达阴性的患者; MVD分别与IGF-Ⅱ和HGF的表达水平呈正相关(r=0.275、0.344)。IGF-Ⅱ、HGF、MVD与卵巢癌FIGO分期、腹膜种植、远处转移及淋巴结转移有关(P<0.05)。结论:IGF-Ⅱ和HGF可促进卵巢癌微血管生成，并参与肿瘤侵袭和转移过程。检测IGF-Ⅱ和HGF的表达可作为卵巢癌侵袭、转移等生物行为及估计预后的有意义指标。

　　【关键词】 卵巢癌;胰岛素样生长因子-Ⅱ;肝细胞生长因子;微血管密度;免疫组化法

　　Study on the expressions of IGF-Ⅱand HGF in ovarian epithelial carcinoma

　　and their correlations with MVD

　　ZHENG Yanli, LIU Manhua, LU Xiaoyan, et al (Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: To investigate the expressions of IGF-Ⅱand HGF in ovarian epithelial carcinoma and their correlations with tumor microvessel density(MVD), tumor and venous vessel invasion and metastasis. Methods: The expressions of IGF-Ⅱand HGF in ovarian epithelial carcinoma and benign ovarian epithelial tumor were evaluated by immunohistochemistry technique, while micro vessels were detected by CD34 antibody and MVD measurement was based on Image Analysis. Results:　The positive expression rates of IGF-Ⅱand HGF in ovarian epithelial carcinoma were 76.2% and 90.5% respectively, but they were 23.3% and 26.7% respectively in benign ovarian epithelial tumor. The expressions of IGF-Ⅱand HGF increased significantly in ovarian epithelial carcinoma, compared with those in benign ovarian epithelial tumor (P<0.05). MVDs of patients with IGF-Ⅱand HGF positive expression were respectively higher than those of patients with IGF-Ⅱand HGF negative expression. There was respectively significant correlation between IGF-Ⅱand HGF expressions and those of MVD (The related coefficients were 0.275 and 0.344 respectively ). The expressions of IGF-Ⅱ, HGF and MVD were associated with FIGO staging, peritoneal seeding, and lymphatic and distant metastasis(P<0.05). Conclusion: The expressions of IGF-Ⅱ and HGF are helpful to tumor micro-angiogenesis, invasion and metastasis, and thus are valuable in predicting tumor biological behavior, such as invasion and metastasis, and estimating prognosis of ovarian carcinoma.

　　[Key words] Ovarian carcinoma;Insulin-like growth factorⅡ;Hepatocyte growth factor;Microvessel density;Immunohistochemistry卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，其病死率居妇科恶性肿瘤首位。研究表明，胰岛素样生长因子-Ⅱ(insulin-like growth factⅡ, IGF-Ⅱ)是一种具有很强促进细胞有丝分裂和增殖活性、促进肿瘤新生血管形成作用的细胞因子。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一种具有刺激多种类型细胞的增殖、分化、形态发生和侵袭运动的多肽生长因子。近年来研究发现这两种细胞因子在多种肿瘤组织，如肺癌、肝癌、胃癌、直肠癌、前列腺癌中过量表达，与肿瘤的发生和肿瘤血管的生成关系密切。本文采用免疫组化方法检测IGF-Ⅱ和HGF在卵巢癌组织中的表达，探讨其与卵巢癌微血管密度(MVD)及卵巢癌发生发展的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 标本和临床资料 收集我院2001年1月~2006年12月期间手术的有完整临床资料的卵巢上皮性癌63例(浆液性37例，黏液性19例，未分化7例)，患者平均年龄51岁。临床分期按FIGO分期标准分期，Ⅰ+Ⅱ期22例; Ⅲ期以上41例。全部病例术前均未接受过放、化疗，术后均经病理确认。15例患者施行盆腔淋巴结清扫术，其余患者予淋巴结活检。术后定期随访，随访时间6~72月。通过病案和通迅随访(63例中有7例因地址不详失访)，记录和收集有关卵巢癌的临床病理参数如临床分期、组织类型、分化程度、淋巴结转移及其愈后等资料。同期选择卵巢浆液性或粘液性瘤30例，患者平均年龄42岁，作为对照。所有组织标本用4%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、备用。

　　1.2 主要试剂 IGF-Ⅱ(AF-292-NA)，HGF兔抗人单克隆抗体(αSC-7969)，为Santa Cruz公司产品。鼠抗人CD34单克隆抗体。即用型S-P检测试剂盒、DAB显色液、SABC检测试剂盒，二抗采用PV-6001/6002试剂盒。所有试剂均购自北京中山金桥生物技术有限公司。

　　1.3 方法 IGF-Ⅱ和HGF均采用免疫组化S-P法(工作浓度1∶100)，按照S-P检测试剂盒说明书所示步骤进行，切片经EDTA(PH8.0)组织抗原修复液高压热修复，用已知IGF-Ⅱ和HGF阳性组织作为对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。IGF-Ⅱ和HGF免疫反应阳性物质主要位于细胞浆，呈棕黄色至棕褐色颗粒为阳性细胞，低倍镜(40×)下取3个着色密集区，高倍镜(400×)下计数。着色细胞百分数，取其均值为x，为制定标准：x<10%或未染色为(-);x≥10%及<50%为(+);x≥50%为(++)。

　　微血管密度(MVD)采用CD34(工作浓度1～50)标记的微血管数量表示。首先在低倍镜(40×)下观察全部视野，在每张切片上选择3个富含血管组织的“热点”区，即棕黄色染色密度最高的区域，然后在中倍镜(200×)下计数热区CD34表达血管数,由计算机自动标记及分析，并求和取平均值作为该例MVD。

　　1.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件包进行统计学分析。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验和Fisher精确概率法检验。相关性采用Spearman等级相关分析，P<0.05示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 IGF-Ⅱ和HGF在卵巢肿瘤中的表达 IGF-Ⅱ和HGF的阳性产物均为棕黄色至棕褐色颗粒，位于卵巢癌细胞胞浆中，且染色程度强，偶见于脉管内皮细胞和间质细胞(图1、2)。63例卵巢癌组织中IGF-Ⅱ表达阳性率为76.2%(48/63)，HGF表达阳性率为90.5%(57/63)。两者在良性上皮性卵巢肿瘤中均为弱阳性表达，良性上皮性卵巢肿瘤中IGF-Ⅱ为23.3%(7/30)，HGF 26.7%(8/30)。IGF-Ⅱ和HGF在卵巢癌与卵巢良性上皮性肿瘤的表达有差异(P<0.05)。

　　2.2 卵巢癌组织中MVD测定及其与卵巢癌各临床病理指标间的关系 CD34阳性产物呈棕黄色的颗粒，主要定位于肿瘤细胞间质的内皮细胞，呈环状或点状(图3)。在卵巢癌组织中，围绕着癌巢的新生血管数量明显增加，血管排列紊乱、密集、扭曲。63例卵巢癌MVD平均为(43.34±7.23)，良性卵巢上皮性肿瘤(27.63±6.79)，两者之间差异有统计学意义(P<0.05)。MVD表达与卵巢癌患者年龄，瘤体大小及组织学类型无关(P>0.05);与卵巢癌FIGO分期、肿瘤分化程度、腹膜种植，远处转移及淋巴结转移有关(P<0.05)(见表1)。

　　2.3 MVD与IGF-Ⅱ及HGF表达的关系 IGF-Ⅱ表达阳性组中MVD的样本均数为39.57±6.83，阴性组为32.56±6.49，MVD在IGF-Ⅱ阳性表达组高于阴性表达组，经t检验两组MVD差异有统计学意义(P=0.003)。HGF表达阳性组中MVD的样本均数为43.50±6.71，阴性组为35.56±5.59，经检验两组MVD差异有统计学意义(P=0.012)。MVD与IGF-Ⅱ及HGF表达均呈正相关(r=0.275、0.344)。

　　2.4 IGF-Ⅱ和HGF与卵巢癌各临床病理因素间的关系 在63例卵巢癌组织中IGF-Ⅱ、HGF表达与卵巢癌患者年龄，瘤体大小及组织学类型无关(均P>0.05);与卵巢癌FIGO分期、肿瘤分化程度、腹膜种植，远处转移及淋巴结转移有相关性(P<0.05)，见表1。

　　3 讨 论

　　由于卵巢癌发病和进展隐匿，确诊时70%已属晚期，晚期卵巢癌5年生存率仅约30%。肿瘤的侵袭与转移是肿瘤发展的最终阶段，也是肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤组织向周围侵袭浸润的同时必伴有新生血管的形成，以提供足够的营养促进肿瘤细胞生长，而血管的形成又加剧了肿瘤细胞的侵袭能力，导致更广泛的转移发生。多项实验研究证明肿瘤血管形成过程中由肿瘤细胞分泌的多种细胞因子来促进。IGF-Ⅱ基因位于第11号染色体短臂上，其编码产生的IGF-Ⅱ蛋白是一种分子量为7500的单链弱酸性多肽，是肿瘤自分泌生长因子，在体内外都有很强的促进细胞分裂、增殖的能力[1]。HGF基因定位于7q21.1上，DNA长度约为70 kbp，包含18个外显子和17个内含子。HGF编码含有728个氨基酸的蛋白质，其与受体c-met特异性结合，激活多条信号转导通路，在促进细胞有丝分裂、细胞运动、血管形成发挥重要作用，从而增强癌细胞的运动和侵袭能力[2]。卵巢癌细胞容易脱落至腹腔形成播散，患者常伴有腹膜种植及大量腹水。研究[3]发现卵巢癌腹水中含有多种生长因子，能激活信号传导通路，并能刺激细胞的形态变化和侵袭运动能力的改变。本研究表明，IGF-Ⅱ、HGF在卵巢癌组织中异常高表达，且IGF-Ⅱ、HGF表达水平的高低与卵巢癌患者FIGO分期、肿瘤分化程度、腹膜种植，远处转移及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。与卵巢癌患者年龄、肿瘤组织学类型无关(P>0.05)。提示IGF-Ⅱ、HGF卵巢组织中的过渡表达与卵巢肿瘤的恶性行为有关。卵巢癌的生长、侵袭和进展与IGF-Ⅱ、HGF有关。随着卵巢癌的进展，IGF-Ⅱ及HGF产生增加，使肿瘤细胞增殖加快，保证了侵袭性强的肿瘤细胞能够不断生长，为肿瘤转移的发生提供了良好的物质基础。

　　实体肿瘤的生长和转移必须依赖于新生血管的形成[4]。在新生血管形成后肿瘤会呈指数倍增长，转移的机会随之增高[5]。免疫组化染色发现在卵巢癌组织中，围绕着癌巢的新生血管数量明显增加，血管排列紊乱、密集、扭曲。MVD在良性上皮性肿瘤及卵巢癌组织中表达差异有统计学意义(P<0.05)。说明卵巢癌细胞可以诱导新的血管形成，以向肿瘤提供大量的营养物质及养分促进肿瘤细胞生长，同时血管的形成又加剧肿瘤细胞的侵袭能力，导致更广泛的转移发生。

　　本实验研究表明，IGF-Ⅱ和HGF表达阳性的患者MVD水平分别高于表达阴性的患者;MVD分别与IGF-Ⅱ和HGF的表达水平呈正相关，提示IGF-Ⅱ和HGF在诱导新的血管生成过程中发挥作用，可能是卵巢癌中主要的促血管生长因子。Laurent等研究发现IGF系统可以明显提高肿瘤细胞中血管内皮生长因子(VEGF)浓度，促进肿瘤血管的形成，在肿瘤的侵袭、转移中起重要作用[6]。研究[7]发现，在进展期上皮性卵巢癌细胞中IGF-Ⅱ基因过度表达，同时IGF-Ⅱ表达是低生存期的一个独立预测因子。

　　近年来，有关IGF-Ⅱ及HGF与恶性肿瘤发生发展中的作用成为国内外研究热点，其参与肿瘤侵袭及转移的具体机制尚不完全明确。检测IGF-Ⅱ、HGF及MVD的表达可作为卵巢癌侵袭、转移等生物行为及估计预后的有意义指标，其可能成为抑制卵巢癌微血管生成治疗的一个新靶点。

　　【参考文献】

　　[1] Mohan S，Jennings JC，Linkhart TA，et al.Primary structure of human skeletal growth factor: homology with human insulin-like growth factor-Ⅱ[J].Biochim Biophys Acta, 1988, 966(1)：44-55.

　　[2] Wong AS,Pelech SL,Woo MM,et al.Coexpression of hepatocyte growth factor-Met: an early step in ovarian carcinogenesis[J].Oncogene, 2001,20(11):1318-1328.

　　[3] Ueoka Y，Kato K，Wake N. Hepatocyte growth factor modulates motility and invasiveness of ovarian carcinomas via ras mediated pathway[J]. Mol Cell Endocrinol, 2003, 202(1-2)：81-88.

　　[4] Folkman J.Tumor angiogenesis and tissue factor[J].Nat Med, 1996，2(2)：167-168.

　　[5] 曲丹妮，郑建华. c-met蛋白与MVD在卵巢肿瘤组织中表达的意义[J]. 哈尔滨医科大学学报, 2002，52(2): 133-136.

　　[6] Laurent B,Frederique L，Sylvie F，et al.Regulation of vascular endothelial growth factor expression by insulin-like growth factor inendometrial adenocarcinoma cells[J].Int J Cancer，2000,85(1):117-123.

　　[7] Sayer RA，Lancaster JM，Pittman J，et al.High insulin-like growth factor-Ⅱ(IGF-Ⅱ)gene expression is an inde-pendent predictor of poor survival for patients with advanced stage serous epithelial ovarian cancer[J].Gynecol Oncol，2005，96(2)：355-361.