KLK10蛋白和骨桥蛋白在上皮性卵巢癌中的表达及意义

　　作者：周明，马小玲，张玉泉 作者单位：(南通大学附属医院妇产科，南通 226001)

　　【摘要】 目的：研究KLK10蛋白和骨桥蛋白(OPN)在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义。方法：应用免疫组化法检测10例上皮性卵巢良性、12例交界性和45例恶性肿瘤中KLK10蛋白和OPN的表达，分析KLK10蛋白和OPN表达与上皮性卵巢癌临床病理及生存状态的关系，并分析KLK10蛋白和OPN表达的相关性。结果：在上皮性卵巢良性、交界性和恶性肿瘤组织中KLK10蛋白表达的阳性率分别为10%、58.33%和86.67%; OPN表达的阳性率分别为0%、41.67%和71.11%;两者三组间阳性率和阳性级别比较均有统计学意义(P<0.05);KLK10蛋白和OPN表达的阳性率和表达强度在晚期组高于早期组，中低分化组高于高分化组，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，生存时间<5年组高于≥5年组，各组之间KLK10蛋白和OPN表达阳性率及阳性级别比较均有统计学意义(P<0.05)。KLK10蛋白和OPN在上皮性卵巢癌中表达呈正相关。结论：KLK10蛋白和OPN在上皮性卵巢良性、交界性和恶性肿瘤细胞中表达的阳性率和表达强度逐渐升高。KLK10蛋白和OPN在上皮性卵巢癌中的表达与临床分期、病理分级、淋巴结转移和5年生存率有关。 KLK10蛋白和OPN在上皮性卵巢癌中的表达呈正相关，可作为上皮性卵巢癌的预后标志物。

　　【关键词】 KLK10蛋白;骨桥蛋白;上皮性卵巢癌;免疫组织化学

　　The expression and clinical significance of KLK10 protein and

　　osteopontin in epithelial ovarian carcinoma

　　ZHOU Ming, MA Xiaoling, ZHANG Yuquan (Affiliated Hospital of Nantong University,Nantong 226001)

　　[Abstract] Objective: 1 To study the expression and the clinical significance of KLK10 protein and Osteopontin(OPN) in EOC. Methods: The expression of KLK10 protein and OPN in 10 epithelial benign ovarian tumors, 12 borderline tumors and 45 malignant tumors was detected by immunohistochemistry, the relationships of the expression of KLK10 protein and OPN, clinicopathologic information and survival state in EOC was analyzed. Results: 1 The expression rate of KLK10 protein and OPN in benign, borderline and malignant ovarian tumors was 10%, 58.33% 86.87%, and 0%, 41.67% ,71.11%,respectively, the expression rate and positive rank of 3 groups was obviously different (P<0.05). 2 The expression rate and intensity of KLK10 protein and OPN in advanced stage of EOC was higher than early stage, in G2, G3 higher than G1, with lymphatic metastasis higher than without lymphatic metastasis, survival <5 years higher than survival ≥5 years. Conclusion:The expression rate and intensity of KLK10 protein and OPN in benign, borderline and malignant epithelial ovarian tumors was stepped up gradually.The expression of KLK10 protein and OPN in EOC was obviously different in clinical stage, pathologic grade, with and without lymphatic metastasis and survival time less than 5 years and more than 5 years (P<0.05).

　　[Key words] KLK10 protein;Ostopontin;Epithelial ovarian carcinoma; Immunohistochemistry

　　卵巢癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在妇科恶性肿瘤中位居第三，死亡率却居首位，占妇科肿瘤死亡人数的47%[1]。在卵巢恶性肿瘤中，上皮性癌约占80%，其5年生存率一直徘徊在20%~30%左右。人类组织激肽释放酶(kallikrein, KLK)是一组大的丝氨酸蛋白酶家族，由15个成员组成，其中与卵巢癌关系密切的成员有KLK4-15，它们可能会成为卵巢癌的生物学标志物[2-3]。KLK10(kallikrein10, KLK10)与卵巢癌的关系，国外研究认为，KLK10蛋白在卵巢癌中高表达，并且这种高表达提示预后不良[4]。KLK10蛋白与卵巢癌的关系，国内尚无人研究。骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种磷酸化糖蛋白，富含唾液酸，是一种重要细胞外基质，可促进肿瘤的生长和转移[5]，但确切机制不清。近年来研究证明OPN可作为肿瘤如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌及肺癌，胰腺癌等的诊断、病情的监测和预后的生物学指标，而OPN与卵巢癌的关系研究国内报道不多。Rosen等[6]研究认为，KLK10、OPN可同时作为上皮性卵巢癌的标志物，具体的机制、在卵巢癌的预后方面及其两者的相关性均未阐明。本研究应用免疫组化染色法，研究KLK10蛋白和OPN 在上皮性卵巢癌细胞内表达与其临床病理及预后的关系以及KLK10蛋白和OPN表达的相关性。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象 调取1998年1月~2002年1月在南通大学附属医院妇科住院手术的45例原发性上皮性卵巢癌患者的病历(均为初次住院手术患者)，并对其生存状态进行随访。选取同期手术的10例良性和12例交界性上皮性卵巢肿瘤组织石蜡块作为对照，请专职病理科医师复阅病理切片确定肿瘤性质。

　　1.2 试剂 羊抗人KLK10多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology，产品编号：Sc-20386);KLK10二抗，(抗羊S-P试剂盒，产品编号：KIT-9710，福州迈新公司);浓缩型抗OPN兔抗人多克隆抗体(产品编号RAB-0295); Eliviion TM plus 广谱试剂盒(产品编号KIT-9710)

　　1.3 实验方法 常规切片，采用ZYMED公司推荐的EnVisionTM+plus Kits二步染色法，检测67例上皮性卵巢肿瘤细胞中KLK10蛋白和OPN的表达。KLK10抗体用PBS 1∶400稀释为工作液，OPN抗体用PBS稀释1∶100稀释为工作液，PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性切片作对照。

　　1.4 结果判定标准 以细胞浆或细胞膜内呈棕黄色细颗粒状着色为KLK10蛋白和OPN表达阳性。参照综合染色强度和阳性细胞数(占总细胞数的百分比)进行半定量处理。(1) 染色强度按下列标准评分：细胞无显色者为0分，细胞呈浅黄色者为1分，细胞呈棕黄色者为2分，细胞呈棕褐色者为3分;(2) 阳性细胞数评分方法：阳性细胞占总细胞数的10%~50%者为2分，51%~80%者为3分，>80%者为4分。上述两相评分(1) + (2)，3分为(+);4~5分为(++);6~7分为(+++)。

　　1.5 统计学方法 采用Stata7.0软件进行统计分析，t检验，Fishers确切概率法。

　　2 结 果

　　2.1 KLK10蛋白和OPN在不同性质卵巢上皮性肿瘤组织中的表达 KLK10蛋白阳性染色为棕黄色，主要位于肿瘤细胞的胞浆内，少量在细胞膜上(图1、2)。由表1可见，KLK10蛋白在良性、交界性和恶性肿瘤中表达阳性率分别为10%(1/10)，58.33%(7/12)和86.67%(39/45)。各组之间KLK10蛋白表达阳性率及阳性级别比较有统计学意义(P<0.05)。OPN在癌细胞的胞浆中表达，呈弥漫的颗粒状表达，间质中不表达(图3、4)。由表1可见，OPN在卵巢良性、交界性和恶性上皮性肿瘤中阳性表达逐渐增加，阳性率分别为0%、41.67%、71.11%，P<0.05，其中只有在恶性上皮性肿瘤中有强阳性表达为23.5%，差异有统计学意义。

　　2.2 KLK10蛋白在卵巢癌中的表达与临床病理及预后的关系 由表2可知，KLK10蛋白在晚期卵巢癌中表达的阳性率和表达强度高于早期，中低分化组高于高分化组，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，生存时间<5年组高于生存时间≥5年组，各组之间KLK10蛋白表达阳性率及阳性级别比较有统计学意义(P<0.05)。由表2可知，KLK10蛋白表达与上皮性卵巢癌患者的年龄、组织类型、血清CA125水平、残余肿瘤直径和有无腹水无关(P>0.05)。OPN在晚期卵巢癌中表达的阳性率和表达强度高于早期，中低分化组高于高分化组，有淋巴结转移组高于无淋巴结转移组，生存时间<5年组高于生存时间≥5年组，各组之间OPN表达阳性率及阳性级别比较有统计学意义(P<0.05)。由表2可知，OPN表达与上皮性卵巢癌患者的年龄、组织类型、血清CA125水平、残余肿瘤直径和有无腹水无关(P>0.05)。

　　3 讨 论

　　3.1 KLK10和OPN的结构、功能及与肿瘤的相关性 KLK10又称NES1(normal epithelial cell-specific1, NES1)基因，是KLK家族，即人类组织激肽释放酶家族的成员，该基因位于19号染色体q13.4位置上，含6个外显子(其中一个未被翻译)和5个内含子，转录1.4 kD mRNA，编码一条含276个氨基酸的蛋白，分子量约30 kD。它的生理机能目前仍然不清。

　　近年研究显示，在激素相关性组织如乳腺癌、前列腺、睾丸癌中KLK10也起抑癌基因的作用，当这些组织癌变时，其表达下降，也有少数病例，其表达异常升高，高表达则提示预后不良[7]。OPN是一种重要细胞外基质结构组分， OPN 基因定位在4q13上[5]， OPN基因所编码的蛋白质的N端有-RGD(Arg-Gly-Asp)序列，与整合素受体特别是γ3结合的特异结构，OPN可以通过与整合素的结合参与细胞的黏附、迁移和信号转导等多种细胞行为的调节;促进肿瘤的形成、浸润和转移。Rosen 等[6]研究认为，KLK10、OPN可以作为上皮性卵巢癌的标志物，具体的机制、在卵巢癌的预后方面及其两者的相关性均未阐明。

　　3.2 卵巢上皮性肿瘤中KLK10蛋白和OPN的表达 Petraki等[8]用免疫组化法研究发现KLK10蛋白在卵巢中表达，但并未报道在正常卵巢中表达的阳性率[8]。本研究发现上皮性良性、交界性和恶性卵巢肿瘤组KLK10蛋白的表达阳性率分别为10%，58.33%和86.67%，三组阳性率及阳性级别组间比较均有统计学意义(P<0.05)。上述结果显示：在交界性肿瘤中已出现KLK10蛋白表达升高，与良性病变中差异显著(P<0.05)。这说明KLK10蛋白的表达升高出现在卵巢恶性肿瘤形成的早期阶段，在卵巢肿瘤由良性向恶性转化发展过程中可能起着某种重要作用。这个结果对鉴别卵巢肿瘤的性质也是有意义的。目前关于OPN与恶性肿瘤的关系研究很多，如胃癌、大肠癌、肝癌和肺癌等，大多研究发现OPN在恶性肿瘤中显著高表达。本实验发现OPN定位在肿瘤细胞的胞浆，颗粒状，间质中很少表达。在良性肿瘤中不表达，而在交界性和恶性中阳性表达率逐渐增高，分别为41.67%、71.11%，三组阳性率及阳性级别组间比较均有统计学意义(P<0.05)。上述结果与国外Kim等[9]研究结果一致。

　　3.3 KLK10和OPN表达与上皮性卵巢癌临床病理及预后的关系及两者的相关性 Luo等[10]检测卵巢癌患者血清中KLK10蛋白含量，发现KLK10蛋白表达水平与临床分期、浆液性上皮组织学类型、分期、分级、不理想的肿瘤细胞减灭术、大的残余灶(直径≥1cm)和对化疗无反应密切相关。我们的研究结果显示：KLK10蛋白在卵巢癌高、中低分化组中表达阳性率分别为50.00%(4/8)和94.59%(35/37)，阳性率有显著性差异(P<0.05)，即中低分化者KLK10蛋白阳性率高于高分化者;KLK10蛋白表达在早期、晚期卵巢癌中表达阳性率有显著性差异(P<0.05)，其阳性率分别为63.64%(7/11)和94.12%(32/34)。有淋巴结转移和无淋巴结转移组KLK10蛋白阳性率分别为96.55%和68.75%，表达差异有统计学意义。生存期<5年组和生存期≥5年组KLK10蛋白表达阳性率分别为93.94%(31/33)，66.67%(8/12)，表达差异有统计学意义(P<0.05)，即生存期<5年者KLK10蛋白表达阳性率高于生存期≥5年者，也就是说高表达者5年生存率低。上述结果与Luo等[10]报道的一致，这说明KLK10蛋白的表达与肿瘤的转移预后有一定关系，即KLK10蛋白的表达越高，临床期别越晚，肿瘤细胞病理分级越高，恶性程度越高，肿瘤生长侵袭更加迅速，更易转移，预后不良。本研究还显示KLK10蛋白表达与患者年龄、组织类型、血清CA125水平、是否有腹水和残余肿瘤直径无关(P>0.05)，这些还有待于进一步大样本的研究。

　　文献报道OPN在卵巢癌中的高表达与手术分期有关，但与细胞组织学类型无关;而O'Neill 报道OPN的表达与浆液性卵巢癌细胞的分化无明显相关性[11]。我们的研究结果显示：OPN在卵巢癌高、中低分化组中表达阳性率分别为25.00%(2/8)和81.08%(30/37)，阳性率有显著性差异(P<0.05);OPN表达在早期、晚期卵巢癌中表达阳性率分别为22.27%(3/11)和85.29%(29/34)，阳性率有显著性差异(P<0.05);有淋巴结转移和无淋巴结转移组OPN阳性率分别为89.65%(26/29)和37.50%(6/16)，表达差异有统计学意义;生存期<5年组和生存期≥5年组OPN表达阳性率分别为87.88%(31/33)，25.00%(3/12)，表达差异有统计学意义(P<0.05)，即生存期<5年者OPN表达阳性率高于生存期≥5年者，也就是说高表达者5年生存率低。一些结果与文献报道的相符， Rosen还报道在CA125弱或不表达的卵巢癌中100%表达人血管舒缓素10(HK10), 血管舒缓素6(HK6),OPN和claudin 3。Mor等[12]报道采用酶联免疫方法检测患者血清中的OPN的浓度发现：血清中OPN水平与癌灶大小、腹水量、病情复发与缓解等均存在相关性，可补充CA125对患者的病情监测和治疗反应，与CA125有相同的变化趋势。因此这些报道与本实验结果与存在差异，其差异原因还需进一步大样本的研究。本研究发现，KLK10蛋白与OPN在上皮性卵巢癌中表达呈正相关，而两者的表达均与血清CA125无明显相关性，因此，可以与CA125一起作为上皮性卵巢癌的预后指标。

　　【参考文献】

　　[1] 张天泽, 徐光炜主编. 肿瘤学[M]. 天津：天津科学技术出版社, 1996: 1963-1970.

　　[2] Yousef GM, Diamandis EP. Expanded human tissue kallikrein family-a novel panel of cancer biomarkers[J]. Tumour Biol, 2002, 23(3):185-192.

　　[3] Diamandis EP, Yousef GM. Human tissue kallikreins: a family of new cancer biomarkers. Clin[J]. Chem, 2002, 48(4):1198-1205.

　　[4] Luo LY, Katsaros D, Scorilas A, et al. Prognostic value of human kallikrein 10 expression in epithelial ovarian carcinoma[J]. Clin Cancer Res，2001, 7(8):2372-2379.

　　[5] Crosby AH,Edwards SJ,Marray TC,et al Genomic organization of the human osteopontin gene :exclusion of the locus from a causative role in the pathogenesis of dentinogenesis imperfecta typeⅡ[J].Genomics ,1995,27(1)：155-160.

　　[6] Rosen DG, Wang L, Atkinson JN, et al Potential markers that complement expression of CA125 in epithelial ovarian cancer[J]. Gynecol Oncol，2005， 20(1)： 18-25.

　　[7] Luo LY, Diamandis EP, Look MP, et.al Higher expression of human kallikrein 10 in breast cancer tissue predicts tamoxifen resistance[J]. Br Cancer, 2002, 86(11):1790-1796.

　　[8] Petraki CD, Karavana VN, Luo LY, et al. Human kallikrein 10 expression in normal tissues by immunohistochemistry[J]. Histochem Cytochem, 2002, 50(9):1247-1261.

　　[9] Kim JH, Skates SJ, Uede T, et al.Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer[J]. JAMA,2002，287:1671-1679.

　　[10] Luo LY, Katsaros D, Scorilas A, et al. The serum concentration of human kallikrein 10 represents a novel biomarker for ovarian cancer diagnosis and prognosis[J]. Cancer Research, 2003, 63(7):807-811.

　　[11] O'Neill CJ, Deavers MT, Malpica A, et alAn immunohistochemical comparison between low-grade and high-grade ovarian serous carcinomas: significantly higher expression of p53, MIB1, BCL2, HER-2/neu, and C-KIT in high-grade neoplasms[J].Am J Surg Pathol，2005，29(8):1034-1041.

　　[12] Mor G, Visintin I, Lai Y, et al Serum protein markers for early detection of ovarian cancer[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2005，102(21):7677-7682.