端粒酶在维吾尔族子宫颈癌与宫颈上皮内瘤样病变中的表达及意义

　　作者：祖菲娅?艾力1, 拉莱?苏祖克2

　　摘要: 目的：探讨端粒酶激活与维吾尔族子宫颈癌的关系。方法：应用重复序列扩增(TRAP)法检测32例宫颈癌，25例各级宫颈上皮内瘤变(CIN)，33例慢性宫颈炎组织的端粒酶活性。结果: 端粒酶阳性率依次为：CIN>宫颈癌>慢性宫颈炎(P<0.05)。CINⅢ级>CINⅠ、Ⅱ级，各组之间具有显著性差异(P<0.05)。端粒酶活性水平：CIN>宫颈癌>慢性宫颈炎;CINⅢ级>CINⅠ，Ⅱ级。端粒酶在宫颈癌早期(Ⅰ期，Ⅱ期)及晚期(Ⅲ，Ⅳ期)之间无差异(P<0.05)，在宫颈癌高分化及中低分化组织中的阳性表达及在宫颈鳞癌与腺癌之间的表达无显著性差异(均P<0.05，)。结论：维吾尔族宫颈癌的发生与端粒酶的激活有关，端粒酶激活是宫颈癌发生的早期事件。

　　关键词：宫颈癌; 端粒酶; TRAPPCR

　　Expression and significance of telomerase activity in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasim in uighur women

　　Zufeiya?Aili, Lalai?Suzuke

　　(Department of Gynecology, First Affiliated Hospital Xinjiang Medical University,Urumqi 830054, China)

　　Abstract: Objective: To study the Expression and significance of telomerase activity in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasim in uighur women. Methods: Telomerase activity was detected by TRAPPCR, in 32 cervical cancer, 25 cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and 33 chronic cervicitis cases. Results: With regard to the positive expression rate of telomerase CIN>cervical cancer>chronic cervicitis; CINⅢ>CINⅠ, Ⅱ(P<0.05).There are no significant differens between early stage and late stage, (P<0.05). Positive rate of telomerase in cervical cancer did not correlate with clinical staging, histological grading and histologic subtypes (P<0.05). Conclusion: Reactivation of telomerase is an early event and may play an important role in uighur women during cervical carcinogenesis and progression.

　　Key words: Cervical carcinoma; telomerase;

　　TRAPPCR端粒位于染色体末端，随着细胞分裂而逐渐缩短，细胞趋向衰亡被认是细胞分裂的“生物钟”。端粒酶是影响端粒长度的主要因素,能以其自身的RNA为模板,向端粒末端添加(TTAGGG)n序列,使端粒延长,从而延长细胞的寿命甚至使其“永生”。近期的研究表明：端粒酶在恶性肿瘤中高表达,但在良性肿瘤和非肿瘤组织中低表达或无表达。为探讨宫颈癌、宫颈上皮内瘤样病变端粒酶活性表达,本文采用端粒重复序列扩增对32例宫颈癌、25例宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及33例慢性宫颈炎组织的新鲜标本中端粒酶活性进行检测。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1组织标本来源选取新疆医科大学第一附属医院及附属肿瘤医院2005年1月至2006年1月诊治的维吾尔族宫颈癌患者标本(活检和手术)32例，宫颈CIN 25例(CINⅠ级4例、Ⅱ级11例，CINⅢ级10例包括3例原位癌)，33例炎症组织标本作为对照组，所有病例均经病理学确证。其中宫颈癌均未进行过放化疗，按FIGO1994年的分期标准，Ⅰ期8例，Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期11例;组织学分型中，鳞癌30例，腺癌2例;组织学分级中，高分化癌7例，中分化癌15例，低分化癌10例。获取的新鲜组织标本立即置-80℃冻存。以上所有的病历均经妇检，阴道镜检查及病理检查证实，临床资料完整。

　　1.1.2端粒酶检测试剂采用北京瑞进罗式诊断有限公司提供的端粒酶检测试剂盒(Roche)。阳性对照为试剂盒提供的已知端粒酶阳性的人胚胎肾细胞系293作为阳性对照，以65℃条件下热处理293细胞提取物10 min作为阴性对照。

　　1.2方法

　　1.2.1端粒酶的检测

　　1.2.1.1组织DNA的提取取30~40 mg的冻存宫颈组织，用无菌眼科剪剪碎，研磨。加200 μl裂解液，冰浴30 min，4℃离心16 000 rpm，20 min。吸取上清至另一eppendorf管中，勿吸入组织或碎片(上清蛋白要求定量1～50 μg)，测定蛋白含量。

　　1.2.1.2PCR扩增取细胞提取液1～5 μl(蛋白含量50 ng)加入25 μl TRAPPCR扩增液，用无菌DEPC水补足至体积50 μl混匀，覆盖无菌石蜡油30 μl后在PCR扩增仪(美国PE扩增仪)上按以下步骤进行引物的延伸及扩增反应：25℃ 30 min、94℃ 5 min循环1个周期后再以94℃ 30 s变性、50℃ 30 s退火、72℃ 90 s延伸，共循环30个周期，最后72℃延伸10 min。

　　12.1.3端粒酶产物的检测取上述PCR产物5 μl加变性液20 μl混匀并置室温10 min，加入杂交液225 μl混匀后取100 μl混合液加到MTP板上，盖上自带盖板，37℃，300 rpm振荡器上振荡2小时。用洗涤液250 μl，洗3次，每次洗1分钟，移出洗液。加100 μl地高辛抗体，室温孵育30 min。移除液体，用250 μl洗液清洗5次，每次1分钟，移除洗液，加100 μl TMB底物液，盖上盖膜，室温孵育并300 rpm振荡器上振荡20 min(蓝色)加100 μl终止液终止反应(由蓝色变黄色)。30 min后终止反应，于30分钟内用酶标仪测定OD450和OD690的吸光度，OD450OD690=A值(端粒酶活性)。阳性对照A为1.092，A<0.019为阴性。

　　1.3统计学处理数据用SPSS13.0及PEMS3.1统计软件处理，端粒酶阳性率比较采用χ2检验，端粒酶活性水平比较采用t检验，P值以0.05为显著性水准。

　　2结果

　　2.1宫颈不同组织中端粒酶阳性及端粒酶活性水平90例宫颈组织中的端粒酶阳性率为45.6%(41/90)，其中32例宫颈癌组织中端粒酶的阳性率为46.9%(15/32)，CIN组织中为76%(19/25)，炎症组织中21.2%(7/33)，由此可见，端粒酶阳性率依次为：CIN>宫颈癌(χ2=10.422，P=0.001)>慢性宫颈炎(χ2=4.779，P=0.029);CINⅢ级>CINⅠ，Ⅱ级(χ2=5.263，P=0.022)，各组之间具有显著性差异(表1)。可见端粒酶活性水平：宫颈CIN>宫颈癌(t=64.988)>慢性宫颈炎(t=46.356);CINⅢ级>CINⅠ，Ⅱ级(t=30.302)。以上P=0.000(表2)。

　　表1宫颈不同组织中端粒酶阳性率　略

　　表2不同宫颈组织中端粒酶活性水平　略

　　2.2宫颈癌不同临床分期，组织学分级，组织类型中端粒酶阳性率端粒酶在各期宫颈癌中的表达率为：Ⅰ～Ⅱ期57.1%，Ⅲ～IV期为27.2%，宫颈癌早期(Ⅰ期，Ⅱ期)及晚期(Ⅲ，Ⅳ)期之间无统计学差异(χ2=3.077，P=0.215)。端粒酶在宫颈癌高分化及中低分化组织中表达差异无统计学意义(χ2=1.205，P=0.272)，端粒酶在宫颈鳞癌与腺癌中的表达无显著性差异(χ2=0.608，P=0.927)(表3)。

　　表3宫颈Ca不同临床分期，组织学分级以及组织学　略

　　3讨论

　　大多数人体正常的组织细胞中无端粒酶表达，而恶性肿瘤细胞则存在着有活性作用的端粒酶，它的存在为染色体末端提供一个保护性“帽子”，防止染色体断裂，重组或降解，保证线性染色体的稳定和完整，从而保证细胞分裂。被激活的端粒酶可以进行端粒DNA合成，补充细胞分裂时丢失的部分端粒，使细胞具有无限繁殖能力，成为优势克隆，获得永生，因此端粒酶的活化自然成为恶性肿瘤的普遍现象。至今已经在超过90%以上的人恶性肿瘤中检测到了端粒酶活性，故端粒酶的激活目前被认为是人类细胞永生化的关键步骤，也是大多数人恶性肿瘤的特点[1]。Zheng[2]等体外宫颈癌发生模型的研究表明端粒酶激活在细胞永生化阶级即出现,在宫颈癌变过程中持续存在,与宫颈癌的发生、进展密切相关;还发现端粒酶活性阳性率在宫颈癌中显著高于CIN及正常宫颈组织中，这提示端粒酶活性检测有助于宫颈癌临床诊断。国外文献报道[3]宫颈癌组织中端粒酶阳性表达率可达80%以上，而且从宫颈正常组织通过癌前病变发展成癌的过程中，伴随宫颈癌变程度的发展，端粒酶活性的表达率呈阶段性升高。本研究结果显示32例维吾尔族宫颈癌组织中端粒酶阳性表达率为49.6%(15/32)，对照组33例宫颈炎为21.2%(7/33)，两组差异有显著性(P<0.05)，说明维吾尔族宫颈癌组织中有端粒酶激活。但本组宫颈癌组织中端粒酶阳性表达较低，与张梦真[4]等报道的91.67%有差异。而且我们还发现端粒酶活性与宫颈癌组织学分级及临床分期无关，与奚玲[5]等报道的不一致,认为可能与以下因素有关：(1)本组大部分患者已为晚期，处于负氮平衡状态，影响了端粒酶蛋白质的合成;(2)部分患者因肿瘤组织生长较快，局部肿瘤体积较大，表面大量坏死，供血不足，肿瘤细胞缺血、缺氧，端粒酶合成能力下降;(3)个别肿瘤恶性表型的发展可能不依赖端粒酶激活，或许还有其他机制，途径参与这些肿瘤的发生、发展及维持端粒的长度;(4)部分恶性肿瘤中端粒较长，随细胞增殖端粒长度不变，而端粒酶呈阴性。本研究发现宫颈腺癌与鳞癌之间的表达无统计学差异，可能因标本数量较少有关。王淑珍[6]等研究结果显示，随着宫颈癌前病变的进展，端粒酶的阳性表达率逐渐增高，CIN患者的阳性表达率明显高于正常宫颈及慢性宫颈炎，活性随着病变程度的增加而增加。Pao[7]等对宫颈癌、宫颈上皮内瘤样变、肿瘤周围组织及正常宫颈组织的端粒酶活性进行研究发现,端粒酶在50%的上皮内瘤样变组织中有阳性表达,并认为端粒酶在上皮内瘤样变与正常宫颈诊断方面可能具有重要价值。本研究结果显示，维吾尔族CIN组织中端粒酶阳性表达率为76%(19/25)、与宫颈癌及慢性宫颈炎组织相比有显著差异(P<0.05)，而且CINⅢ级组织中端粒酶阳性表达率高于CINⅠ、Ⅱ级，两组差异具有显著性，与其它文献报道基本一致[8]。提示端粒酶在癌前病变中就有相当数量的表达，端粒酶的激活是宫颈癌发生的早期事件。因端粒酶表达阳性的CIN患者其病变进展的可能性大[8]，故可作为判断维吾尔族宫颈癌前病变发生的标志物，来协助诊断早期宫颈癌。端粒酶表达阳性是否是CIN病变进展的确切信号，有待于进一步研究。我们研究中慢性宫颈炎端粒酶阳性表达率为21.2%，类似的结果也见于其他报道[10]，其原因与慢性炎症组织中有增殖能力的细胞有关，可检测到端粒酶活性。我们在良性宫颈病变及轻度、中重度上皮内瘤样病变和宫颈癌中均检测到端粒酶表达，且差异有显著性，说明检测实体瘤的端粒酶表达是肿瘤诊断的一个辅助手段。根据上述结果，我们认为，端粒酶的激活发生在宫颈癌变的早期，与肿瘤的发生发展密切相关，故可将端粒酶活性检测作为一种肿瘤标志物用于临床，有助于宫颈癌的早期诊断。

　　参考文献:

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　　[4]奚玲. 端粒酶及其于宫颈癌关系研究进展[J]. 国外医学妇产科许学分册, 2002, 29(4):211213.

　　[5]张梦真, 乔玉环, 王福丰, 等. 宫颈癌组织中端粒酶活性定量定性测定[J]. 河南医科大学学报, 2001,36(2),125127.

　　[6]王淑珍, 孙建衡, 张伟,等. 子宫颈上皮内瘤变端粒酶活性的研究[J]. 中华妇产科杂志,2001,36(5):275277.

　　[7]Pao CC, Tseng CJ, Lin CY, et al. Differential expression of telomerase activity in human cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia lesions[J]. J Clin Oncol, 1997,15:19321937.

　　[8]许争峰, 胡娅莉, 王迅美, 等. 端粒酶在宫颈癌及癌前病变活检标本中的表达及意义[J]. 中国优生与遗传杂志, 2000,8(6):2425.

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　　[10]刘晓军, 邹雅群, 郭辰虹,等. 常见恶性肿瘤端粒酶活性检测[J]. 中华肿瘤杂志, 2001,23(1):2127.

　　作者简介：祖菲娅?艾力(1969-)，女(维吾尔族),副主任医师，研究方向：妇科肿瘤。

　　新疆医科大学1第一附属医院妇科, 2病理教研室, 新疆乌鲁木齐830054