鸟氨酸脱羧酶基因表达对老年妇女子宫内膜癌发生、发展的影响

　　作者：张晓慧 钱志红 龙启芳 张爱荣 作者单位：苏州大学附属第二医院妇产科，江苏 苏州 215004

　　【摘要】 目的 探讨鸟氨酸脱羧酶(ODC)与子宫内膜癌发生、发展的关系，为子宫内膜癌基因诊断和治疗提供理论依据。方法 采用RTPCR、免疫组化、Western印迹蛋白技术检测50例老年妇女子宫内膜癌组织中ODC mRNA和蛋白的表达，同时结合临床病理特征及预后进行分析。另外，用MTT法观察ODC不可逆性抑制剂α二氟甲基鸟氨酸(DFMO)作用后子宫内膜癌HEC1B细胞株的增殖状况。结果 子宫内膜癌组织中ODC mRNA表达和蛋白阳性表达率均明显高于癌旁组织和正常子宫内膜组织(P值均<0.05);ODC蛋白阳性表达率在不同年龄、组织学类型间无显著性差异(P值均>0.05)，在不同病理分级、FIGO分期、浸润肌层深度、淋巴结转移与否组间有显著性差异;生存3年以上者子宫内膜癌组织中ODC蛋白阳性表达率明显低于生存3年以下者。MTT法生长曲线检测数据显示DFMO作用后HEC1B细胞增殖明显比对照组细胞缓慢。结论 ODC在老年妇女子宫内膜癌中呈高表达，在子宫内膜癌的发生、发展过程中发挥着重要的作用，可作为判断老年妇女子宫内膜癌生物学行为及患者预后的参考指标;DFMO对子宫内膜癌HEC1B细胞株生长具有显著抑制作用，ODC有望成为子宫内膜癌靶向基因治疗的新靶点。

　　【关键词】 子宫内膜癌;鸟氨酸脱羧酶;基因表达

　　鸟氨酸脱羧酶(ornitnine decarboxylase,ODC)是由两个相同亚基组成的二聚体，分子量约为105 kD存在于细胞浆，以磷酸吡哆醛为辅基，半衰期短，只有15 min，活性低且诱导性强，是调节多胺合成最关键的酶〔1～3〕。多胺是机体中一种重要的阳离子脂肪族有机胺，包括精胺、精脒和腐胺，其普遍存在于各种组织细胞中，通过与生物分子如核酸、蛋白质、磷酸酯等共价结合促进DNA的复制与蛋白质的合成〔4～6〕，在细胞增殖、分化、细胞周期的维持中起重要的作用。子宫内膜癌是一组原发于子宫内膜的恶性肿瘤，是妇科恶性肿瘤中最常见的一种。目前，尚未见国内外有关ODC与子宫内膜癌关系的研究。近年来，我国妇女尤其是60岁以上的老年妇女子宫内膜癌发病率明显上升，且与中青年子宫内膜癌相比较，发现时临床分期晚，组织学类型恶性程度高，肌层浸润深、预后差。本实验从mRNA和蛋白质的水平上探讨ODC基因表达和老年妇女子宫内膜癌的关系，为其基因诊断和基因治疗提供理论依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　收集2002年5月～2004年9月间山东大学第二医院妇产科手术切除且经病理证实的子宫内膜癌及其相应的癌旁组织、正常子宫内膜组织各50例;年龄61～80(平均67.5)岁;其中内膜样腺癌42例，腺鳞癌2例，透明细胞癌3例，浆液性乳头状腺癌3例;FIGO分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期10例，Ⅲ期24例;病理分级G1级18例，G2级13例，G3级19例;浸润肌层深度>1/2的35例;有淋巴结转移的21例。50例患者术前均未接受放疗、化疗及激素治疗且无住院期间死亡，术后随访至2006年6月，实访45例，失访5例，随访率90.0%。同时选取同期非老年妇女(36～59岁)子宫内膜癌25例作为对照研究。各标本均经常规处理后置于-80℃低温冰箱保存。

　　1.2 主要试剂

　　RTPCR试剂盒购自TaKaRa公司，ODC及作为内参照的βactin的PCR反应寡核苷酸引物由上海Sangon公司合成。其他各种化学试剂均为进口或国产分析纯。兔抗人多克隆抗体0DC及免疫组织化学试剂盒PV9000均购自北京中山生物技术公司。Western印迹试剂购自美国Santa Cruz公司。MTT试剂购自Sigma公司。HEC1B细胞购自中科院上海细胞所。

　　1.3 方法

　　1.3.1 RTPCR检测ODC mRNA的表达

　　主要包括提取总RNA、反转录(RT)、PCR扩增，βactin基因作为内参照。产物2%琼脂凝胶电泳，Smart View凝胶成像分析系统分析结果。(ODC：上游：5′GAGCACATCCCAAAGCAAAGT3′;下游：5′TCCAGAGTCTGACGGAAAGTA3′，产物长度369 bp)。

　　1.3.2 多聚复合物酶标(Wax Envision)免疫组织化学染色

　　结果判定：ODC蛋白染色阳性为细胞浆呈清晰棕红色颗粒。在高倍镜下观察，当阳性细胞<5%时，定为“-”，5%～25%为“+”，26%～50%为“”，>50%为“”。阴性对照采用0.01 mol/L PBS代替一抗，具体步骤按照试剂盒说明书。

　　1.3.3 Western印迹检测ODC蛋白的表达

　　主要包括：细胞总蛋白的提取，SDSPAGE电泳，蛋白质转印及抗体染色，Ecl试剂检测、X光电曝光及显影。

　　1.3.4 ODC的不可逆性抑制剂α二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine，DFMO)对HEC1B细胞增殖的影响

　　将DFMO按不同浓度加入HEC1B细胞中，设PBS缓冲液细胞株为对照组，用MTT法观察不同处理组肿瘤细胞增殖。

　　1.4 统计方法

　　应用SPSS13.0软件包进行统计学分析，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析。计数资料采用行X列表资料和四修表资料χ2检验及Fisher精确概率法。

　　2 结 果

　　2.1 ODC mRNA在不同子宫内膜组织中的表达

　　在子宫内膜癌组织中的表达均显著高于正常子宫内膜组织和癌旁组织，差异显著(均P<0.05)，癌旁组织高于正常子宫内膜组织(P<0.05)(表1、图1)。表1 ODC mRNA在不同子宫内膜组织中的表达(略)

　　2.2 免疫组化检测ODC蛋白表达

　　表2、图2显示子宫内膜癌组织中ODC蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织和正常子宫内膜组织(均P<0.05);在不同年龄、组织学类型间无显著性差异(均P>0.05)，在不同病理分级、FIGO分期、浸润肌层深度、淋巴结转移与否及预后组间有显著性差异(均P<0.05)。表2 ODC蛋白在子宫内膜癌中的表达及其与临床病理特征的关系(略)

　　2.3 Western印迹检测ODC蛋白表达

　　图3显示子宫内膜癌组织中ODC蛋白表达量明显高于癌旁组织和正常子宫内膜组织(图3)。

　　2.4 DFMO对HEC1B细胞增殖的影响

　　将浓度为1.0和5.0 mol/L的DFMO及PBS缓冲液分别加入3组HEC1B细胞培养液中，绘制生长曲线。检测数据表明DFMO作用后细胞的增殖明显比对照组细胞缓慢，且有浓度依赖性。表明DFMO对子宫内膜癌HEC1B细胞株生长具有显著抑制作用(图4)。

　　3 讨 论

　　ODC是多胺生物合成的关键酶，能催化鸟氨酸脱羧生成腐胺，腐胺又可顺序生成精脒和精胺。其在维持肿瘤细胞恶性表型中起重要作用，抑制多胺合成可抑制肿瘤细胞增殖并诱导其分化及凋亡，引起肿瘤恶性表型逆转〔7，8〕。

　　本实验应用RTPCR和免疫组化方法检测子宫内膜癌组织中ODC mRNA和蛋白的表达。结果显示ODC mRNA在子宫内膜癌组织中的表达强度明显高于癌旁组织和正常子宫内膜组织Western印迹检测结果亦显示子宫内膜癌组织中ODC蛋白表达量明显高于癌旁组织和正常子宫内膜组织。分别从mRNA和蛋白质水平证实ODC在子宫内膜癌的发生、发展中起重要作用。研究还发现ODC蛋白在不同年龄、组织学类型间无显著性差异，提示ODC对促进子宫内膜癌的发生、发展可能具有普遍意义。这和临床上肿瘤病理类型与肿瘤侵袭、转移密切相 关的观点相矛盾，可能的解释是子宫内膜癌的发生、发展是多基因、多阶段和多途径相互作用的结果。免疫组化结果亦显示ODC蛋白在不同病理分级、浸润肌层深度、FIGO分期、淋巴结转移与否组间有显著性差异。提示肿瘤的低分化程度和较晚的Ⅰ临床分期中ODC蛋白过度表达，而ODC的过表达可导致子宫内膜癌细胞的不断增殖，进而促进子宫内膜癌细胞的侵袭、浸润且淋巴结转移率明显增高。同时，生存3年以上者子宫内膜癌组织中ODC蛋白阳性表达率明显低于生存3年以下者，进一步从蛋白质水平证明了ODC表达增强是老年妇女子宫内膜组织癌变及浸润演进过程中的重要因素，可作为判断老年妇女子宫内膜癌生物学行为及患者预后的参考指标。

　　同时，本实验通过体外细胞培养，用MTT法检测ODC不可逆性抑制剂DFMO对子宫内膜癌HEC1B细胞增殖的影响。结果显示DFMO作用后细胞的增殖明显比对照组细胞缓慢，且有浓度依赖性，这为子宫内膜癌的生物治疗提供了实验室依据，且提示ODC有望成为子宫内膜癌靶向基因治疗的新靶点。

　　总之，本研究初步证明了ODC在老年妇女子宫内膜癌中呈高表达，在子宫内膜癌的发生、发展过程中发挥着重要的作用，可作为判断老年妇女子宫内膜癌生物学行为及患者预后的参考指标。而ODC促进细胞恶变的具体机制有待进一步的研究，这对于了解子宫内膜癌发生的分子机制，对子宫内膜癌进行基因干预、治疗具有重要意义。

　　【参考文献】

　　1 Huang Y，Pledgie A，Caseroin RA Jr，et al.Molecular mechanisms of polyamine analogs in cancer cells〔J〕.Anticancer Drugs，2005;16(3)：22941.

　　2 Choil KS，Suh YH，Kim WH，et al.Stable siRNAmediated silencing of antizyme inhibitor：regulation of ornithine decarboxylase activity〔J〕. Biochem Biophys Res Commun，2005：328(1)：20612.

　　3 Wallon UM，O′Brien TG.Polyamines modulate carcinogen induced mutagenesis in vivo〔J〕.Environ Mol Mutagen，2005;45(1)：629.

　　4 Carlisle DL，Devereux WL，Hacker A，et al.Growth status significantly affects the response of human lung cancer cells to antitumor polyamineanalogue exposure〔J〕.Clin Cancer Res，2002;8(8)：26849.

　　5 Asher G，Bercovich Z，Tsvetkov P，et al.20S Proteasomal degradation of ornithine decarboxylase is regulated by NQ01〔J〕.Mol Cell，2005;17(5)：64555.

　　6 Cui XS，Kim NH.Polyamines inhibit apoptosis in porcine parthenotes developing in vitro〔J〕.Mol Reprod Dev，2005;70(4)：4717.

　　7 Wolter F， Ulrich S，Stein J.Molecular mechanisms of the chemopreventive effects of resveratrol and its analogs in colorectal cancer：key role of polyamines〔J〕? J Nutr，2004;134(12)：321922.

　　8 Subhi AL，Tang B，Balsara BR，et al.Loss of methylthioadenosine phosphorylase and elevated ornithine decarboxylase is common in pancreatic cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2004;10(21)：72906.