更年春方对去卵巢大鼠胶原纤维作用的研究

　　作者：袁怡清 王文君 周文江 李大金 作者单位：复旦大学附属妇产科医院，上海 200011

　　【摘要】 目的 观察更年春方(GNC)对去卵巢大鼠皮肤组织胶原纤维的作用并探讨可能发生的机制。方法 10～12月龄SD雌性大鼠60只随机分为假手术组(S组)、生理盐水组(N组)、GNC高剂量组(H组)、GNC低剂量组(L组)、尼尔雌醇组(E组)，每组12只。除S组做假性手术外，其余各组均行双侧卵巢切除术。术后2 w开始给予灌药，N组灌服生理盐水，H组灌服GNC 2 ml/d、L组灌服GNC 1 mg/d、E组灌服尼尔雌醇1 ml，1次/w。3个月后测定大鼠血清雌二醇(E2)的水平，取大鼠背部皮肤组织进行组织学及免疫组织化学观察，测定皮肤组织羟脯氨酸(HYP)水平，RealTime-PCR定量分析皮肤组织表皮细胞生长因子受体(EGFR)、ER亚型mRNA的表达。结果 GNC及尼尔雌醇均能提高大鼠皮肤组织HYP含量，提高皮肤组织EGFR、ERα、ERβmRNA的表达，血清E2水平均未升高。结论 更年春方能增加去卵巢大鼠皮肤组织胶原纤维的表达，此作用与GNC影响胶原蛋白合成途径有关。其机制可能与提高皮肤组织ERmRNA的表达有关。

　　【关键词】 更年春方;皮肤;胶原;表皮生长因子受体(EGFR);雌激素受体亚型

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(30472259),上海市卫生局中医药科研基金资助项目(2004L020A)

　　Effects of Gengnianchun formula on skin collagen fibers in ovariectomized SD rats

　　YUAN Yi-Qing,WANG Wen-Jun,ZHOU Wen-Jiang,et al.

　　Obstetric and Gynecology Hospital,Fudan University,Shanghai 200011, China

　　【Abstract】 Objective To study the possible effects of Gengnianchun formula (GNC) on skin collagen in ovariectomized (OVX) SD rats and to investigate its possible mechanism. Methods 60 ten to twelve months old SD rats were randomly divided into sham-operated (S),saline (N), high (H) and low (L) dosage of GNC and nilestriol(E)groups.Except S group, the rats in the other groups ovariectomized bilaterally 2 weeks ago received corresponding drugs,respectively.Serum E2 levels were determined 3 months later in five groups. Skin tissue of the back area were got for histological and immunohistological study and measurement of hydroxyproline (HYP). Results PCR was performed to analyze the expression of epidermal growth factor receptor(EGFR), ERα,ERβ of skin tissue. Results The amount of HYP significantly increased after treated with GNC or nilestriol.The mRNA level of EGFR, ERα,ERβ of skin tissue all enhanced dramaticly after treated with GNC or nilestriol.The serum E2 level had no significant increase. Conclusions GNC could improve the amount of skin collagen fibers of OVX SD rats by enhancing collagen biosynthesis.The mechanism may associate with the increased expression of ER subtype of skin tissue.

　　【Key words】 Gengnianchun formula; Skin; Collagen; Epidermal growth factor receptor (EGFR); Estrogen receptor subtype

　　绝经后妇女体内雌激素含量下降，全身各系统步入老化过程。皮肤组织的明显变化为变薄、萎缩、皱纹增多，这些改变与胶原纤维的变化密切相关。雌激素补充增加胶原纤维的含量在以往的研究中已被证实〔1〕。但雌激素补充导致致癌可能性的增加〔2〕，限制了此方面临床运用的开展。更年春方(GNC)是根据围绝经期肾阴虚这一主要证候，以滋肾柔肝、清心泻火为治则制定的。临床验证治疗更年期综合症有良好疗效〔3〕。本实验在观察GNC对大鼠皮肤组织胶原纤维作用的同时，探讨可能的作用机制，以期待GNC此方面的临床运用。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物

　　10～12月龄SD雌性大鼠60只，体重(500±50)g，购于复旦大学实验动物部，合格证：SCKX(沪-2002-0002)，按清洁级标准饲养。自由摄入自来水和标准颗粒饲料。

　　1.2 药物、试剂与仪器

　　中药复方“更年春(GNC)”由生地、知母、枸杞子、仙灵脾、白芍、龟板等12味中药组成，由上海汇丰大药房有限公司制成口服液，每毫升含成药1.35 g。尼尔雌醇：上海国药集团有限公司华能制药厂生产，批号：06031。羟脯氨酸(HYP)试剂盒、蛋白定量(双缩脲法)试剂盒均购自南京建成生物研究所。ERβ抗体(PA1-311)为ABR公司产品。ERα抗体(BA0345)、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均为博士德公司产品。RT试剂盒(E×SsriptTMRT reagent Kit 序列号DRR037S)及RealTime-PCR试剂盒(SyBrR○ premix ExTaqTM序列号DRR041A)均为TaKaRa公司产品。TRIzol试剂为Invitrogen公司产品。PCR引物由TaKaRa公司合成。GAPDH(143 bp)上游引物(正义)：5′-ggC ACA gTC AAg gCT gAg AAT g-3′,下游引物(反义)：5′-Atg gTg gTg AAg Acg CCA gTA-3′;ERα(145 bp)正义：5′-TgT TAC gAA gTg ggC Atg Atg AA-3′，反义：5′-gCC AAA ggT Tgg CAg CTC TC-3′;ERβ(86 bp)正义：5′-CCT CAC TAA gCT ggC ggA CAA-3′,反义：5′-CCA ACA ggC TgA gCT CCA CA-3′;表皮细胞生长因子受体(EGFR)(150 bp)正义：5′-Atg CTg ATA gCC gCC CAA Ag-3′,反义：5′-CCT CCA TCA ggg CTC ggT AA-3′。PCR扩增仪(GeneAmp PCR System 2400),实时定量PCR仪(ABI PRISM 7000)，Beckman Du640紫外分光光度计，FS-2型可调高速分散器(江苏省金坛县环保仪器厂)。

　　1.3 方法

　　1.3.1 模型制备

　　大鼠随机分为假手术组(S组)、生理盐水组(N组)、GNC高剂量组(H组)、GNC低剂量组(L组)、尼尔雌醇组(E组)，每组12只。除S组做假性手术(去除卵巢周围腹腔少许脂肪)外，其余各组均行双侧卵巢切除术。术后2 d每天给予青霉素8万U肌注预防感染。术后1 w行大鼠阴道涂片观察脱落细胞情况以确认手术成功。

　　1.3.2 给药方法

　　术后2 w开始灌胃给药。H组：灌服GNC 2 ml/d(相当于成人每公斤体重剂量的20倍);L组：灌服GNC 1 ml/d;E组：灌服尼尔雌醇1 ml(含药0.167 g/ml)，1次/w(相当于成人每公斤体重剂量的20倍);其余两组给予生理盐水1 ml/d。连续灌药3个月。因实验周期较长，大鼠发生自然死亡致实验结束时样本有所减少。

　　1.3.3 检测指标

　　大鼠处死后，取颈动脉血，采用化学发光法测定血清雌二醇(E2)的水平。10%质量分数皮肤匀浆液的制备：大鼠处死后，经8%Na2S溶液去毛，剪取背部皮肤组织2 cm2，乙醚脱脂处理，滤纸拭干后,精密称取0.2 g皮肤组织块，剪碎后倒入匀浆管中，加入1.8 g预冷的生理盐水，用组织捣碎机制成10%质量分数的组织匀浆液(转速12 000 r/min，匀浆40 s，间隔10 s，连续4～5次，在冰水中进行)。取少量组织匀浆液涂片，显微镜下观察细胞破碎情况，若破碎不完全，则增加匀浆次数，使细胞内容物完全游离在液相中。精密称取0.03 g皮肤组织块，采用样本碱水解法测定HYP含量。取10%皮肤匀浆液采用双缩脲法定量组织蛋白浓度。操作步骤均遵照试剂盒说明。结果由组织蛋白含量矫正。

　　1.3.4 皮肤的组织学及免疫组织化学观察

　　皮肤组织石蜡切片的制备：大鼠处死后，8%Na2S溶液去毛，剪取背部皮肤组织2 cm2，经10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片(6 μm)。皮肤的组织学观察：切片常规HE染色，光镜观察。皮肤免疫组织化学法(SABC法)观察：切片经常规防脱片处理、脱蜡、水化、3%H2O2室温孵育5 min灭活内源性酶、微波热修复抗原、室温5%BSA封闭20 min后，一抗(ERα抗体1∶500稀释、ERβ抗体1∶100稀释)37℃孵育1 h、二抗37℃孵育20 min、SABC37℃孵育20 min、DAB染色、苏木素复染、脱水、透明、封片、镜检。一抗稀释浓度、二抗孵育、染色均遵照试剂盒说明。

　　1.3.5 RT-PCR定量分析

　　(1)取皮肤组织50～100 mg，以Trizol、氯仿和异丙醇抽提总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性;(2)根据RT试剂盒说明，37℃逆转录反应15 min;85℃逆转录酶失活5 s;(3)根据RT-PCR试剂盒说明，采用两步法PCR扩增标准程序：95℃预变性10 s，1个循环。95℃变性5s，60℃退火/延伸31 s，40个循环。对ERα、ERβ、EGFR分别进行扩增反应。同时扩增管家基因GAPDH作为内参照。(4)记录各个反应体系的Ct值(PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数)。Ct值表示PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。因此，Ct值越小，表示反转录产物DNA模板浓度越高。△Ct=Ct(目的基因)-Ct(管家基因)，表示目的基因经管家基因矫正值。同样，△Ct值越小，该目的基因mRNA表达水平相对越高。

　　1.4 统计分析

　　所有数据均采用Stata7.0软件包进行单因素方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠血清E2水平的变化

　　H组、L组、E组、N组及S组大鼠血清E2水平分别为(39.6±4.0)，(37.9±4.7)，(35.4±6.5)，(36.4±3.9)和(47.3±10.1)pg/ml。与N组相比，S组大鼠血清E2水平显著升高(P<0.01)。与N组相比，H组、L组及E组血清E2水平无显著性差异(P>0.05)。

　　2.2 各组大鼠皮肤组织组织羟脯氨酸含量的变化

　　H组、L组、E组、N组及S组大鼠皮肤组织羟脯氨酸含量分别为(4.260 4±0.255 3)，(3.635 3±0.354 1)，(4.011 1±0.496 6)，(3.193 7±0.413 8)和(4.490 1±0.401 9)μg/mg湿重。与N组相比，H组、L组、E组及S组大鼠皮肤组织羟脯氨酸和胶原蛋白含量均显著增加(P<0.01，P<0.05)。

　　2.3 皮肤组织切片经HE染色后光学显微镜观察

　　与N组相比，H组、L组、E组及S组胶原纤维长度更长，排列更致密(图1)。

　　2.4 皮肤免疫组织化学法观察

　　ERα、ERβ在大鼠真皮组织中均有表达，表现为胞核、胞内的表达(真皮的细胞主要为成纤维细胞)。同时在皮下组织中的腺体也有表达(图2)。

　　2.5 GNC对皮肤组织ER亚型的调节

　　与N组相比，H组、L组、E组及S组ERαmRNA的表达均显著增加(P<0.01或P<0.05)。与N组相比，H组、E组及S组ERβmRNA的表达显著增加(P<0.01或P<0.05);L组与N组比较，ERβmRNA的表达无显著性差异(P>0.05)(表1)。

　　2.6 GNC对皮肤组织EGFRmRNA的影响

　　与N组相比，H组、L组、E组及S组EGFRmRNA的表达均显著增加(P<0.01或P<0.05)(表1)。表1 大鼠皮肤组织ERα、ERβ、EGFRmRNA Ct(GAPDH矫正)值(略)

　　3 讨 论

　　绝经后妇女体内雌激素含量下降，皮肤衰老加剧。补充雌激素能延缓皮肤衰老〔1〕，但是增加致癌的危险性〔2〕，而且延缓皮肤衰老目前不作为雌激素替代治疗的适应证。中医中药以其疗效好，副作用少而受到人们关注。中医理论认为：肺主气，主宣发，外合皮毛。肺具有宣发卫气，输精于皮毛的功能。精衰、肺气不宣则皮肤憔悴枯槁。肾为先天之本，主藏精。精为人体正气之本，精气充盈，则五脏充盛。《素问·上古天真论》说：“女子七八天癸竭，精少，肾脏衰，形体皆极。”同时，五行之中肺肾为母子之脏，相互为用。因此，延缓皮肤衰老能通过补肾治疗实现，提示更年春具有延缓皮肤衰老的作用。

　　皮肤萎缩、变薄、皱纹增多等老化现象的组织学表现主要体现在真皮结缔组织改变。真皮结缔组织由胶原纤维构成为主。胶原纤维的主要成分是胶原蛋白。本实验中大鼠皮肤组织切片的镜检表现为GNC及雌激素组胶原纤维组织长度更长、排列更紧密，提示GNC及雌激素能改善胶原纤维排列构成，从而延缓皮肤衰老。同时，对胶原纤维量的比较可以更直接地体现皮肤衰老的程度。胶原蛋白是一组分子结构相近的蛋白质，其整个结构可以用(Gly-X-Y)n来表示，X、Y位的氨基酸多为羟脯氨酸或脯氨酸，在胶原蛋白侧向排列形成胶原纤维的过程中，脯氨酸由羟化酶催化成羟脯氨酸。另外，羟脯氨酸在其他蛋白质中含量甚微〔4〕。因此，羟脯氨酸含量可以代表胶原纤维量。本结果显示：GNC及雌激素组能增加大鼠皮肤组织胶原纤维含量，从而量化了GNC及雌激素延缓皮肤衰老的作用。

　　胶原蛋白由真皮组织中少量的成纤维细胞合成，因此，成纤维细胞的量及活性与胶原蛋白含量相关。表皮细胞生长因子(EGF)可以促进成纤维细胞的增殖及蛋白的合成〔4〕，EGF属于细胞因子，它的作用依赖于信号传导：即EGFR、启动基因转录从而发挥效应。本实验显示：GNC及雌激素组EGFRmRNA均有显著增加，即GNC及雌激素均能通过EGFR、EGF、成纤维细胞途径而增加胶原蛋白合成。

　　胶原蛋白含量取决于其合成与降解的动态平衡。基质金属蛋白酶(MMP)是降解结缔组织的一组酶系，既往研究不能确定大鼠胶原蛋白降解以哪一亚型MMP为主〔5，6〕。同时，MMP以不活化形式存在于皮肤结缔组织中，在UVA照射〔7〕或者皮肤组织受损〔8〕后才能活化发挥作用，而UVA照射、受损的程度在老化过程中是增强的。可见，胶原蛋白的降解是多因素参与的复杂过程。本实验的建模与实际老化过程不同，并不包含外界因素的参与。因此，GNC及雌激素与大鼠皮肤组织胶原蛋白降解作用的相关性还有待进一步研究。

　　本实验从形态、量化、机制三方面证实了GNC与雌激素一样，能增加胶原蛋白的含量、改善胶原纤维的排列结构，以延缓皮肤老化。另外，在皮肤免疫组织化学法观察中发现，ERα、ERβ在真皮组织均有表达;RT-PCR的结果显示GNC及雌激素组皮肤组织的ERα、ERβmRNA表达均显著增加;血清E2水平测定显示GNC并不提高大鼠血清E2水平。因此，GNC可能是通过提高真皮组织ER水平来增强雌激素对真皮组织的生理效应，即提高胶原蛋白的含量、改善胶原纤维的排列结构，以延缓皮肤老化。鉴于以往研究提示，GNC对子宫没有不良反应〔9〕，而雌激素的补充有致癌的潜在危险性〔2〕。因此，GNC对胶原蛋白、胶原纤维的作用影响是更为安全的。至于GNC此方面作用在绝经后妇女皮肤组织的体现以及临床运用还有待进一步研究。

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