天花粉蛋白对绒癌细胞JEG-3体外增殖和HLA-G、HLA-E表达的影响

　　作者：王建英 李勇　 程建新 范立侨 吴小华 赵群　 王世杰 作者单位：河北医科大学第四医院妇产科，河北 石家庄 050011

　　【摘要】 目的 探讨天花粉蛋白对绒癌细胞JEG-3体外增殖及对HLA-G、HLA-E表达的影响，为临床应用天花粉蛋白抗肿瘤治疗提供理论依据。方法 体外培养高表达HLA-G、HLA-E的绒癌细胞株JEG-3，采用MTT法检测天花粉蛋白对细胞增殖的影响，通过RT-PCR技术和流式细胞分析技术观察其对该细胞中HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白水平表达的影响。结果 实验组不同浓度天花粉蛋白对JEG-3细胞均表现出一定程度的抑制作用，呈浓度依赖性。同100 μg/ml组和对照组相比，1 000 μg/ml组天花粉蛋白能明显下调JEG-3细胞中HLA-G mRNA和蛋白水平(均P<0.01)。各组之间HLA-E mRNA和蛋白水平有统计学差异(分别为P=0.014，P=0.028)。进一步组间比较，1 000 μg/ml组HLA-E mRNA和蛋白水平明显低于对照组(分别为P=0.004，P=0.009)。结论 天花粉蛋白能显著抑制绒癌JEG-3细胞的增殖，并能下调该细胞系HLA-G、HLA-E mRNA和蛋白水平，提示天花粉蛋白抗肿瘤的另一机制可能是其可以打破机体对肿瘤的免疫耐受，从而遏制肿瘤的生长。

　　【关键词】 人类白细胞抗原;JEG-3;免疫逃逸;天花粉蛋白

　　人类白细胞抗原- G(human leukocyte antigen G，HLA-G)和人类白细胞抗原-E(human leukocyte antigen E，HLA-E)，主要选择性分布在母体胎儿界面绒毛膜外细胞滋养层，通过多种机制抑制自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞等的杀伤作用，在母胎免疫耐受，维持正常妊娠中起到重要调节作用。进一步研究表明HLA-G、HLA-E可通过免疫抑制途径，在肿瘤发生过程中起到免疫逃逸作用〔1〕。天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是从葫芦科栝楼属植物栝楼的根块中提取出的一种碱性蛋白，属于Ⅰ型核糖体失活蛋白。该药对绒毛滋养层细胞有选择性作用，能使绒毛广泛性变性坏死，纤维素沉着，绒毛间隙血运阻断，促使前列腺素的释放而引起流产。临床主要用于引产，因其具有N-糖苷酶活性，能水解真核细胞核糖体28SrRNA腺苷酸的N-C糖苷键，使核糖体不可逆失活，从而抑制蛋白质的合成，使其应用范围涉及到抗肿瘤、抗病毒等领域〔2〕。天花粉蛋白与HLA-G、HLA-E关系的研究，目前国内外尚未见报道。本研究将天花粉蛋白直接作用于高表达HLA-G和HLA-E的绒癌细胞株JEG-3，观察天花粉蛋白对JEG-3细胞的杀伤活性及其对该细胞中HLA-G、HLA-E水平的影响，探索天花粉蛋白的抗肿瘤机制，为临床应用提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 培养细胞 绒毛膜癌细胞JEG-3，购于中国科学院动物研究所计划生育及生殖生物学国家重点实验室。

　　1.1.2 试剂 天花粉蛋白注射液购于上海金山制药厂;RPMI1640细胞培养基购于美国Gibco公司;胎牛血清购于杭州四季青公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于Sigma公司;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购于Fermentas公司;Trizol试剂盒购于美国Invitrogen公司;引物由上海生工生物工程公司合成;HLA-G、HLA-E单克隆抗体购于英国Abcam公司。

　　1.1.3 仪器设备 酶标仪 Fluostar(BMG，德国);CO2培养箱(Heraeus，德国);倒置显微镜(Olympus，日本);HEALORCE超净工作台，PCR仪(Mastercycler，eppendorf,德国);凝胶分析成像系统(VILBER，LourMAT，法国);Epics-XL Ⅱ型流式细胞仪(Beckman-Coulter,美国)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 JEG-3细胞培养 用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml链霉素、2 mmmol/L的DMEM/F12培养液，在37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养,以0.25%胰蛋白酶消化，2～3 d传代一次。

　　1.2.2 MTT法检测天花粉蛋白对JEG-3细胞增殖的影响 试验组天花粉蛋白终浓度分别为1、10、100、500、1 000 μg/ml。采用MTT比色法检测细胞的增殖情况，取对数生长期的细胞，调整浓度为2×105ml-1，接种于96孔培养板中，每孔100 μl，贴壁培养24 h后分别加入不同浓度的药物，每个浓度设6个复孔，每板设3个空白对照孔。细胞培养72 h后，每孔加入10 μl MTT(浓度为5 mg/ml)，继续培养4 h后，弃培养液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，振荡10 min，酶标仪在600 nm处测定吸光度(A)值，并按如下公式计算各组细胞的生长抑制率。实验重复5次。

　　细胞生长抑制率=(对照孔A值-实验孔A值)/对照孔A值×100%。

　　1.2.3 RT-PCR技术检测天花粉蛋白对JEG-3细胞HLA-G、HLA-E mRNA水平的影响 试验组天花粉蛋白终浓度为100、1 000 μg/ml，同时设无药对照组。药物作用于JEG-3细胞72 h，用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，用紫外分光光度法定量RNA。将等量的RNA反转录为cDNA第1链，以获得的逆转录产物为模板进行PCR，扩增HLA-G基因、HLA-E基因和β-actin 基因。使用凝胶分析系统对扩增条带进行密度分析，以平均灰度值代表相应基因的表达量，并除以β-actin的平均灰度值，所得数值作为各扩增产物mRNA的相对表达量。扩增条件为：HLA-G为94℃预变性3 min，94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸7 min;HLA-E为94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火55 s，72℃延伸2 min，40个循环，72℃延伸7 min。1%琼脂糖凝胶电泳80 V 30 min，观察基因表达变化。引物序列〔3〕：HLA-G上游引物为5′-AGACGCCAAGGATGGTGGTCA-3′，下游引物为5′-AGGAAAGGTGATTGGGGAAGG-3′;HLA-E上游引物为5′-TCCGAGCAAAAGTCAAAT-3′，下游引物为5′-AGATCCAAGGAGAACCAG-3′;β-actin上游引物5′-AAGAGAGGCATCCTCACCCT-3′，下游引物为5′-GGAAGGAAGGCTGGAAG-3′。扩增产物：HLA-G为770 bp，HLA-E为447 bp，β-actin为619 bp。实验重复5次。

　　1.2.4 流式细胞技术测定天花粉蛋白对JEG-3细胞HLA-G、HLA-E蛋白表达的影响 试验组天花粉蛋白终浓度为100和1 000 μg/ml，药物作用于JEG-3细胞72 h，取单细胞悬液1×106ml-1，分别加入1∶100的鼠抗人单克隆抗体HLA-G、HLA-E 100 μl，孵育30 min，PBS洗涤去上清，加入1∶20羊抗鼠FITC-IgG 100 μl，孵育30 min，PBS冲洗未结合抗体，再加入PBS，经500目铜网过滤后上机检测，设本底对照和阴性对照。以荧光指数(FI)表示蛋白的相对含量。实验重复5次。

　　1.2.5 统计学方法 数据以x±s表示，采用SPSS统计软件进行单因素方差分析。

　　2 结果

　　2.1 天花粉蛋白对JEG-3细胞增殖的影响 与对照组相比，各浓度天花粉蛋白对JEG-3细胞均有不同程度的杀伤作用，呈浓度依赖性(P<0.05)。低浓度细胞杀伤力较弱，100 μg/ml时，抑制率为9.03%，浓度达500 μg/ml以上时，抑制作用呈明显上升趋势，1 000 μg/ml时，抑制率为62.24%。见图1。

　　图1 天花粉蛋白抑制JEG-3细胞的浓度效应曲线(略)

　　2.2 天花粉蛋白对JEG-3细胞中HLA-G mRNA和蛋白水平的影响 天花粉蛋白作用于JEG-3细胞72 h后，对照组、100 μg/ml组和1 000 μg/ml组HLA-G mRNA光密度比值分别为0.973 6±0.042 6、0.967 7±0.017 2、0.859 1±0.010 9;荧光指数分别为1.017 4±0.046 4、0.957 7±0.034 8、0.800 2±0.048 5。经统计学分析，1 000 μg/ml组HLA-G mRNA和蛋白水平明显低于100 μg/ml组和对照组(均P<0.01);后两组比较，差异无统计学意义。

　　2.3 天花粉蛋白对JEG-3细胞中HLA-E mRNA水平和蛋白水平的影响 天花粉蛋白作用于JEG-3细胞72 h后，对照组、100 μg/ml组和1 000 μg/ml组HLA-E mRNA光密度比值分别为0.549 9±0.013 5、0.529 5±0.015 1、0.511 7±0.021 6;荧光指数分别为1.010 1±0.049 1、0.976 9±0.009 0、0.951 4±0.012 9。经统计学分析，各组之间HLA-E mRNA和蛋白水平有统计学差异(分别为F=6.257,P=0.014;F=4.902,P=0.028)。进一步组间比较，1 000 μg/ml组HLA-E mRNA和蛋白水平明显低于对照组(分别为P=0.004，P=0.009)。

　　3 讨论

　　在肿瘤发生发展的过程中，肿瘤细胞和宿主的免疫系统相互影响，相互制约。正常生理情况下，免疫系统发挥免疫监视作用，识别肿瘤细胞的非己抗原，产生免疫应答，破坏肿瘤细胞，阻止肿瘤发展。这种免疫监视作用的主要效应细胞是CTL和NK细胞，CTL对肿瘤细胞的识别要依赖对肿瘤细胞表面的主要组织相容性复合体-Ⅰ(major histocompatibility complex,MHC-Ⅰ)类分子的识别。对于不表达MHC-Ⅰ类分子的肿瘤细胞，NK细胞发挥其细胞毒作用以攻击肿瘤细胞。

　　与此同时，肿瘤细胞通过多种途径逃避机体的免疫监视作用，包括经典的MHC-Ⅰ类分子丢失或变构，导致CTL杀伤功能的丧失;另外肿瘤细胞在丢失MHC-Ⅰ类分子的同时可高表达非经典的MHC-Ⅰ类分子(如HLA-G、HLA-E)，传递强烈的杀伤抑制信号，致使肿瘤细胞在逃逸CTL的杀伤作用后又逃逸NK细胞的杀伤作用。

　　NK细胞受体包括两类，即免疫球蛋白超家族和C型凝聚素超家族，每一类又包括抑制性受体和活化性受体。免疫球蛋白超家族中抑制性受体KIRs(killer cell inhibitory receptors)有ILT-2和ILT-4，识别HLA-G。C型凝聚素超家族抑制性受体CD94/NKG2A，识别HLA-E〔4〕。HLA-G和HLA-E具有相似的NK抑制功能，其多态性有限，组织分布广泛。HLA-G与KIR结合后，激活KIR胞浆部分含有的免疫受体酪氨酸抑制基序，该基序与自身MHC-Ⅰ类分子的结合后，可转导负调控信号，抑制NK细胞活化。HLA-E需要与源于其他HLA-Ⅰ类分子等位基因前导序列的特异性肽段结合，这一肽段必须能稳定HLA-E的表达，与HLA-E结合成为CD94/NKG2A的识别受体，抑制NK细胞及部分T淋巴细胞的细胞毒作用〔5〕。HLA-G和HLA-E具有互补或协同作用，前者能促进和稳定后者的表达。

　　HLA-G的高表达依赖于肿瘤微环境中的活化刺激剂，如IFN-γ、GM-CSF、IL-2、IL-10等，均可增强HLA-G蛋白的表达，对HLA-E表达也有一定促进作用〔6〕。因其在母体胎儿界面绒毛膜外细胞滋养层大量表达，陈春玲等〔7〕研究发现，HCG在HLA-G的表达调节上具有重要作用，高表达的HCG可能在绒癌中通过上调HLA-G参与免疫逃逸方面具有重要意义。2006年Yie等〔8〕研究报道了黄体酮、绒毛膜促性腺激素、孕激素可通过上调HLA-G的水平以达到保胎的目的，由此推测临床的引产药物如天花粉蛋白、米非司酮、利凡诺等引起流产的机制可能与它们能下调HLA-G、HLA-E的水平有关，进而推测其在免疫逃逸方面的抗肿瘤机制。

　　天花粉为葫芦科植物栝楼的干燥根，有清肺化痰、养胃生津之功，传统医学用于热病烦渴、肺热燥咳、疮疡肿痛等。天花粉蛋白为天花粉的有效成分，近年来通过对其结构和功能的研究，发现不仅有传统医学作用，还有抗肿瘤的作用。天花粉蛋白的抗肿瘤机制主要有以下几方面：诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞蛋白质合成，提高红细胞免疫功能，提高NK细胞的杀伤活性，促进细胞因子的分泌，激活补体系统等〔2，9〕。

　　本研究表明，天花粉蛋白对JEG-3细胞具有很强的抑制作用，呈剂量依赖性。高浓度的天花粉蛋白作用于JEG-3细胞72 h，可以下调HLA-G、HLA-E基因 mRNA和蛋白水平。推测其提高NK细胞杀伤活性的抗肿瘤机制可能是通过下调HLA-G和HLA-E水平，阻止肿瘤细胞与NK细胞的抑制性受体结合，从而打破机体对肿瘤的免疫耐受，恢复效应细胞的杀瘤作用，遏制肿瘤的生长。这也为肿瘤的治疗提供了新的发展方向，尤其对于癌组织高表达HLA-G、HLA-E的患者或常规药物耐药的患者，在进行肿瘤免疫治疗研究过程中，应该充分考虑肿瘤细胞表达HLA-G、HLA-E抗原的影响。

　　【参考文献】

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　　2 高富红,孙 健,吴国娟.天花粉蛋白抗肿瘤作用机理研究概况〔J〕.动物医学进展,2005;26(11):5-7.

　　3 Hurks HM,Valter MM,Wilson L,et al.Uveal melanoma：no expression of HLA-G〔J〕.Invest Ophthalmol Vis Sci,2001;42(13):3081-4.

　　4 Masilamani M,Nguyen C,Kabat J,et al.CD94/NKG2A inhibits NK cell activation by disrupting the actin network at the immunological synapse〔J〕.J Immunol,2006;177:3590-6.

　　5 Bland TA，Lemberg MK,Mcmichacl AT,et al.Requirement of the proteasome for the trimming of signal peptide-derived epitopes presented by the nonclassical major histocompatibility complex class Ⅰ molecule HLA-E〔J〕.Biol Chem,2003;278:33747-52.

　　6 Gobin SJ,van den Elsen PJ.Transcriptional regulation of the MHC class Ⅰb genes HLA-E，HLA-F，and HLA-G〔J〕.Hum Immunol,2000;61:1102-7.

　　7 陈春玲,廖秦平.HCG促进绒癌细胞系中HLA-G的表达〔J〕.中国妇产科临床杂志,2004;5(2):113-4.

　　8 Yie SM,Xiao R,Librach CL.Progesterone regulates HLA-G gene expression through a novel progesterone response element〔J〕.Hum Reprod,2006;21:2538-44.

　　9 孙 健,吴志全,薛 琼.天花粉蛋白抑制肝细胞癌肺转移的实验研究〔J〕.中华肝胆外科杂志,2005;11(4):253-6.